研究背景神经源性膀胱（Neurogenic bladder,NB）是小儿外科常见的疾病,目前的各种治疗办法只能缓解病人的症状,无法从根本上对膀胱储尿、排尿的功能进行改善。一个重要的原因在于,随着病情的进展多数患儿会出现膀胱纤维化的病理改变,膀胱容量明显减小,顺应性降低,出现显著小梁化改变,正常的膀胱壁组织被异常增生的结缔组织的浸润取代,最终形成一个小容积、高压力的囊袋,导致膀胱失去正常功能。因而研究导致膀胱发生纤维化的主要致病因素并采取有效的干预措施对阻止疾病的进展具有非常重要的意义。既往研究证实,胶原蛋白等细胞外基质成分沉积于不同器官,如心、肝、肺等,可导致不同病理状态下的器官纤维化,与这些器官类似,膀胱纤维化的特点是膀胱壁内胶原沉积。结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor,CTGF）可能在介导组织、器官纤维化的发生、发展中起十分重要的作用。膀胱失神经支配后会引起膀胱纤维化,这可能是由于功能不全的神经细胞,无法给膀胱细胞提供必要的营养物质,进而导致膀胱细胞功能紊乱,最终导致纤维化的发生。既往研究发现膀胱逼尿肌的功能失调,与支配逼尿肌神经的功能具有相关性。我们据此猜测,神经支配及神经营养物质对膀胱纤维化过程有某种作用。施万细胞（Schwann cell）是外周神经系统中具有重要功能的一种胶质细胞,它可以通过分泌包含脑源性神经营养因子（Brain-derived neurotrophic factor,BDNF）在内 的多种神经营养因子发挥神经营养、促进神经组织再生等作用。目前还没有相关研究揭示施万细胞在膀胱纤维化中的作用。本次研究共分为2个部分,第一部分为:大鼠失神经支配膀胱纤维化模型的建立及CTGF在膀胱纤维化中的作用研究;第二部分为:施万细胞和BDNF在膀胱平滑肌细胞纤维化中的作用及可能的机制研究。第一部分大鼠失神经支配膀胱纤维化模型的建立及CTGF在膀胱纤维化中的作用研究研究目的采用大鼠去神经支配建立NB膀胱纤维化模型,观察不同时间点膀胱组织形态学的变化以及CTGF随着膀胱纤维化的发展的变化趋势。分离出膀胱平滑肌细胞（Bladder smooth muscle cells,BSMCs）并培养,应用CTGF作用于培养的BSMCs,观察纤维化相关指标的变化,研究CTGF在膀胱纤维化中的作用。研究方法应用雌性SD大鼠去神经支配建立NB膀胱纤维化模型。采用体重160-200g,成年雌性SD大鼠32只,将大鼠随机分为4组（n=8/组）,其中一组接受假手术,10天后处死,另三组采用电灼破坏双侧盆神经节的方法建立去神经支配模型,分别在去神经10天、20天和30天后处死。摘取大鼠膀胱组织,进行苏木精伊红（Hematoxylin and eosin,H&E）染色,观察膀胱壁组织结构的变化;再进行Masson染色进一步评价膀胱组织有无纤维化及纤维化的程度。应用免疫组织化学方法检测膀胱组织中CTGF的表达。切取SD大鼠膀胱组织,分离并培养BSMCs,用CTGF处理BSMCs,应用免疫荧光染色观察α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达的变化,应用蛋白质免疫印迹（Western Blot）方法检测Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白（CollagenⅠ,ColⅢ;Collagen Ⅲ,Col Ⅲ）的表达水平,探索CTGF对纤维化的作用。结果1.膀胱组织H&E染色特点:在膀胱去神经支配构建的NB大鼠模型中,膀胱组织平滑肌细胞排列紊乱,逼尿肌细胞被增多的胶原纤维分割。在粘膜下层、肌层等可见炎性细胞浸润,另外随着造模时间的延长,膀胱平滑肌组织显著减少,而膀胱壁纤维结缔组织明显增生。2.Masson染色结果:与H&E染色一致,NB大鼠模型中呈红染的膀胱平滑肌组织以时间依赖性方式显著减少,蓝染的胶原纤维显著增加（与对照组比较,NB第10天,P<0.05;NB第20天,P<0.01;NB第30天,P<0.01）,提示膀胱组织纤维化在逐渐加重。以上结果表明,大鼠NB模型建立成功。3.CTGF免疫组织化学染色结果:在NB大鼠模型中,膀胱组织平滑肌及粘膜移行上皮可见CTGF着色明显,平滑肌细胞内可见粗大的棕色颗粒沉积,造模后20天CTGF表达最明显（与对照组比较,NB第10天,P>0.05;NB第20天,P<0.0001;NB第30天,P<0.001）,粘膜下层无明显棕色颗粒沉积。这些结果表明CTGF在NB模型组膀胱组织中的表达显著增加,提示其可能在膀胱纤维化发生中起重要作用。4.为了进一步证实CTGF对膀胱纤维化发生的影响,分离出原代BSMCs,并施加CTGF作用。免疫荧光染色发现,用CTGF处理后BSMCs的α-SMA显著增加（P<0.0001）;Western blot蛋白印迹分析显示BSMCs的Col Ⅰ和Col Ⅲ明显增加（P<0.01）。提示CTGF可能在NB中促进BSMCs的纤维化。结论1.电灼破坏双侧盆神经节的方法可成功建立大鼠去神经支配致膀胱纤维化的模型。2.失神经支配可导致膀胱纤维化的发生,CTGF可能在膀胱纤维化发生中起重要促进作用。第二部分施万细胞对膀胱平滑肌细胞纤维化的保护作用及其机制的研究研究目的检测大鼠膀胱纤维化模型不同时间段膀胱组织中BDNF表达水平,观察去神经支配的大鼠膀胱组织中BDNF含量的变化趋势。分离出BSMCs和施万细胞。将BSMCs进行单独培养或与施万细胞共培养,在培养的细胞体系中应用CTGF诱导纤维化的发生,检测不同培养体系中α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白的表达水平,观察施万细胞对BSMCs纤维化有无抑制作用。进一步实验探究施万细胞对BSMCs纤维化的作用是否是由BDNF介导。通过检测不同实验组基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）和组织金属蛋白酶抑制剂-1（tissue inhibitor of matrix metalloproteinases 1,TIMP-1）表达情况,进一步揭示施万细胞和BDNF对BSMCs纤维化作用的潜在作用机制。研究方法利用本实验第一部分大鼠去神经支配建立的膀胱纤维化模型,通过酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent,ELISA）检测失神经第10天、20天和30天膀胱组织中BDNF的表达,观察去神经支配的大鼠膀胱组织中BDNF含量的变化趋势。从新生SD大鼠的坐骨神经中分离出施万细胞,与BSMCs共培养,施加CTGF诱导BSMCs,应用免疫荧光染色观察α-SMA表达,Western Blot方法检测Col Ⅰ和Col Ⅲ的表达水平,对比共培养体系与BSMCs单独培养纤维化指标的差异,评估施万细胞在膀胱纤维化中的作用。进一步通过ELISA检测BDNF在CTGF干预的共培养体系与单独培养的BSMCs中的变化情况,初步探索施万细胞对膀胱纤维化产生保护作用是否由BDNF介导。β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色检测施万细胞有无发生衰老,以排除施万细胞衰老对共培养体系实验结果的影响。根据是否与施万细胞共培养、施加BDNF作用等因素的差异设立不同的实验组:A组:BSMCs对照组,B组:BSMCs+CTGF作用,C组:BSMCs与施万细胞共培养+CTGF作用,D组:BSMCs+BDNF+CTGF作用。应用免疫荧光染色观察α-SMA、Col Ⅰ和Col Ⅲ表达的变化,进一步验证施万细胞对BSMCs纤维化的保护作用由BDNF介导。应用实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）检测各组 MMP-1、MMP-2 和 TIMP-1 mRNA 表达情况,揭示BDNF对BSMCs纤维化抑制作用的潜在机制。结果1.NB大鼠膀胱组织中BDNF含量显著降低。通过ELISA检测膀胱组织BDNF,发现NB去神经支配的大鼠膀胱组织中BDNF明显减少,且呈时间依赖性地降低（与对照组比较,NB第10天,P<0.01;NB第20天,P<0.001;NB第30天,P<0.0001）,这表明BDNF可能在NB膀胱纤维化中发挥保护作用。2.施万细胞能显著减轻BSMCs的纤维化。免疫荧光染色结果显示,在经过CTGF诱导纤维化之后,相较于BSMCs单独培养,BSMCs与施万细胞共培养体系中α-SMA表达降低（P<0.0001）,Western Blot结果显示BSMCs与施万细胞共培养体系中的Col Ⅰ和Col Ⅲ含量也显著降低（Col Ⅰ,P<0.001;Col Ⅲ,P<0.01）。这些结果表明,施万细胞能明显减轻CTGF诱导的BSMCs纤维化,并可能在NB膀胱纤维化中发挥保护作用。3.酶联免疫吸附试验表明,与单独培养的BSMCs相比,在施万细胞与BSMCs共培养体系中,BDNF表达显著增加（P<0.01）,这表明施万细胞对BSMCs纤维化的保护作用可能是通过BDNF介导的。4.β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色显示各组的阳性密度相当,表明施万细胞在CTGF干预及共培养体系均没有发生衰老。5.在进一步实验中,免疫荧光染色法观察到B组与A组比较,其α-SMA、ColⅠ和Col Ⅲ表达增强（P<0.0001）,这进一步验证了 CTGF能促进BSMCs纤维化的发生。C组与B组比较,其α-SMA表达降低（P<0.0001）,ColⅠ表达降低（P<0.05）,Col Ⅲ 表达降低（P<0.01）。D 组与 B 组比较,其 α-SMA、ColⅠ和 ColⅢ表达降低（P<0.0001）。提示施万细胞和BDNF均能抑制CTGF诱导的BSMCs的纤维化,施万细胞对纤维化的保护作用可能是通过BDNF产生的。6.通过对MMP-1、MMP-2和TIMP-1 mRNA表达的检测发现,B组与A组比较,MMP-1、MMP-2mRNA 表达降低,TIMP-1 mRNA 表达升高（P<0.0001）,提示CTGF可通过下调BSMCs中MMP-1 mRNA、MMP-2mRNA表达,上调TIMP-1 mRNA的表达促进纤维化的发生。同B组比较,C组MMP-1 mRNA（P<0.01）、MMP-2 mRNA（P<0.05）表达升高,TIMP-1 mRNA 表达降低（P<0.0001）;D 组MMP-1 mRNA（P<0.0001）、MMP-2 mRNA（P<0.01）亦存在表达升高,TIMP-1 mRNA也表现出表达降低（P<0.0001）,与C组中的表达变化趋势一致,施万细胞与BDNF均可逆转CTGF诱导BSMCs纤维化过程中的MMP-1、MMP-2 mRNA的表达下调与TIMP-1 mRNA的表达上调,进一步揭示了施万细胞可能通过分泌BDNF对BSMCs中MMP-1、MMP-2、TIMP-1表达水平进行调节,从而抑制纤维化的发生。结论1.施万细胞显著抑制BSMCs纤维化,这种作用与其产生BDNF的功能有关。2.施万细胞可能通过分泌BDNF对BSMCs中MMP-1、MMP-2、TIMP-1表达水平进行调节,从而抑制膀胱纤维化的发生。