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成肌调节因子(Myogenic regulatory factors, MRFs)属于bHLH型蛋白,是目前公认的骨骼肌发生的最主要调控因子,其生物学活性保证了机体骨骼肌细胞的正常发育,同时也与肉用动物的生产性能息息相关。这类调节因子由两个亚族构成,一类是由MyoD1和Myf5构成,参与胚胎发育时期成肌细胞的激活、发生,属于成肌决定因子(determination-class MRFs);另一类负责成肌细胞的分化、融合,属于成肌分化因子(differentiation-class MRFs),其中典型的为MyoG。目前,关于MRFs家族的生物学功能的研究主要集中在小鼠和人类,对羊MRFs的报道甚少。故本实验通过克隆成肌决定因子亚族典型成员MyoD1和成肌分化因子亚族典型成员MyoG,构建体外真核表达载体采用异位表达的方式验证其表达活性与成肌活力,并通过睾丸注射法制备转基因肉羊,最终获得MyoD1和MyoG过表达肉羊,对转基因肉羊新品种的创制提供参考或育种素材。主要研究内容如下：1.骨骼肌卫星细胞的分离及其成肌分化根据骨骼肌卫星细胞的独特生理位置,对骨骼肌卫星细胞分离方法加以改进,经肌丝分离、细胞释放和差速贴壁纯化等步骤获得了高纯度的卫星细胞。经间接免疫荧光鉴定显示：92.5±3.4%的细胞为Pax-7+细胞,93.0±1.8%的细胞为MyoD细胞,表明SMSC纯度在90%以上；经生长速度测定显示SSC具有较快的生长速度,呈典型的“S”型生长；通过比较成肌诱导体系Ⅰ、Ⅱ的成肌效果,发现无血清培养基具备更佳的诱导效果,并对成肌诱导体系Ⅱ诱导24h后gSMSC进行IFA鉴定,结果显示其Desmin阳性率为92.3±1.1%,MyHC阳性率为93.0±1.2%,表明诱导至24h时有92%的细胞进入成肌分化过程。2. MyoDl与MyoG基因的克隆及生物信息学分析采用TriZol法提取成肌诱导分化24hgSMSC总RNA,经反转录,通过设计MyoD1、MyoG特异性引物,利用PrimeSTAR Max DNA polymerase系统PCR体外克隆山羊MyoD1和MyoG基因的完整CDS,经T-A克隆后递交上海Invitrogen进行测序分析。根据测序结果与绵羊、牛、猪、人和鼠进行同源比较,结果表明MyoD1、MyoG基因克隆成功,MyoD1和MyoG基因在物种之间有较高同源性,其与绵羊的编码氨基酸同源性均为100%。通过在线工具分析显示MyoD1和MyoG蛋白均不含信号肽,是细胞核定位的疏水性蛋白；经NCBI-CCD分析显示MyoD1、 MyoG均含有典型的bHLH结构,此外MyoD1蛋白还含有Myf5亚族(成肌决定因子亚族)典型结构。3.过表达MyoDl基因山羊皮肤成纤维细胞系建立及其成肌诱导分化研究采用组织贴壁法分离山羊皮肤成纤维细胞(goat skin fibroblast, GSF),并构建pEGFP-MyoDl真核表达载体。采用LipofectaminTM LT.X脂质体介导pEGFP-MyoD1质粒转染GSF,通过400μg/mL的G418连续14d的筛选后,采用IFA检测MyoD1和Myf5的表达；采用成肌诱导培养对MyoD1异位表达GSF细胞株进行成肌诱导分化,在分化处理2-3d时采用IFA检测MyoG、Desmin和MyHC等成肌分化早期标志,结果显示细胞90%以上细胞进入成肌分化状态。表明MyoD1基因的异位表达能够诱导GSF等细胞向成肌方向分化。4. MyoG真核表达载体的构建与基因免疫法制备anti-MyoG血清利用分子生物学方法构建MyoG真核表达载体pcDNA3.0-MyoG和真核融合表达载体pEGFP-MyoG。 pcDNA3.0-MyoG经PEI按1μg：1.5μg包裹形成质粒-脂质体复合物后,按100μg/只的剂量肌肉注射小鼠股四头肌,在第一次基础免疫和三次加强免疫后采用眼球采血法收集抗血清。抗血清经IFA鉴定其抗体效价,并与anti-eGFP比较共同检测eGFP-MyoG融合蛋白以确定其抗体特异性,结果显示抗血清能够特异性识别MyoG蛋白,可用于后续试验检测。5.睾丸注射法制备转MyoD1绵羊和转MyoG基因山羊质粒(pEGFP-MyoD1或pEGFP-MyoG)经线性化后,与PEI以1：2的比例形成质粒-脂质体复合物,按每侧睾丸300μL(100μg)的剂量进行注射,在第二次加强注射1Od后,进行配种。配种完成后解剖获得小鼠睾丸用于体视荧光显微镜观察,显示质粒-脂质体复合物注射处理的小鼠附睾管中含有绿色荧光物质,过精子涂片显示精子活动剧烈,且精子头部含有大量绿色荧光物质。同睾丸注射法制备转基因小鼠一样,采用随机打点注射的方法按3mg质粒／(侧·只)的剂量对湖羊(或徐淮山羊)进行睾丸注射,其中,pEGFP-MyoD1-PEI复合物注射处理湖羊公羊睾丸,pEGFP-MyoG-PEI复合物注射处理徐淮山羊。在第一次注射7天后加强注射一次,加强注射40d后与母羊进行自然交配。睾丸注射法制备转基因湖羊和山羊,第一代累计获得4只转MyoD1-eGFP基因湖羊,阳性率6.7%(4/59)；获得13只转eGFP-MyoG基因山羊,阳性率21.67%(13/60)。