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【研究目的】1.采用气管滴注的方式进行激发给药,改进TDI哮喘小鼠模型建立的方案,并对模型的建立进行评价。2.观察TDI哮喘过程中ROR-γt、Foxp3、IL-17A和TSLP基因m RNA表达及其启动子区甲基化变化,探讨TSLP及Th17/Treg细胞平衡在TDI哮喘发病中的作用。3.观察TSLP中和抗体干预对TDI哮喘的治疗作用以及TSLP与Th17/Treg细胞平衡间的相互作用,探讨TDI哮喘的发病机制。【研究方法】1.动物模型的建立选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠20只,适应环境1周后,随机分为TDI哮喘组(TDI组)和溶剂对照组(AOO组)。TDI组小鼠于第1、8天耳背分别涂抹20μL 0.3%TDI致敏(溶剂为丙酮:橄榄油=2:3),第15天采用气管滴注法给予20μL 0.01%TDI进行激发(溶剂为丙酮:橄榄油=1:4)。AOO组小鼠,按照上述方法给予等量的溶剂。两组小鼠在同样的饲养条件下饲养并观察小鼠一般生长状况,每天测量小鼠体重。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数和细胞分类计数并将BALF中炎细胞涂片,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测BALF白细胞介素4(IL-4)和IFN-γ水平的变化,每组另取4只小鼠多聚甲醛全身灌流固定后取部分肺组织苏木素-伊红(HE)染色观察肺组织病理学改变。2.TSLP表达及Th17/Treg细胞平衡在TDI哮喘中的变化及其相关基因启动子区甲基化改变模式选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠32只,适应环境1周后,随机分为TDI组和AOO组。按上述方法建立TDI哮喘小鼠模型。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠检测BALF中细胞总数和细胞分类计数,每组各取4只多聚甲醛全身灌流固定后取部分肺组织HE染色观察气管和肺组织病理学改变。每组各取6只小鼠部分肺组织,实时荧光定量逆转录RT-PCR和Mass Array飞行质谱法分别检测TDI组和AOO组小鼠肺组织中ROR-γt、Foxp3、IL-17A和TSLP基因mRNA和基因启动子区甲基化水平。3.TSLP中和抗体干预对小鼠TDI哮喘的保护作用选用SPF级健康雄性8-10周龄BALB/c小鼠48只,适应环境1周后,随机分为TDI组、AOO组和TSLP中和抗体干预组(TSLP中和组),TDI组小鼠于第1、8天耳背分别涂抹20μL0.3%TDI致敏,(溶剂为丙酮:橄榄油=2:3),第15天采用气管滴注法给予20μL 0.01%TDI进行激发(溶剂为丙酮:橄榄油=1:4)。TSLP中和组在激发前30min给予TSLP中和抗体腹腔注射(15mg/kg),AOO组小鼠,按照上述方法给予等量的溶剂。三组小鼠在同样的饲养条件下饲养并观察小鼠一般生长状况。于TDI激发结束后24小时处死小鼠,每组各取6只小鼠血清检测Ig E水平的变化,同时取肺组织匀浆测IL-4、IFN-γ、IL-13的变化水平,每组各取4只小鼠多聚甲醛全身灌流固定后HE染色观察三组小鼠气管和肺组织病理学改变,每组各取6只小鼠的部分肺组织Western blot检测TSLP蛋白的表达水平,其余部分肺组织用实时荧光定量逆转录RT-PCR法分别检测肺组织中ROR-γt、Foxp3、IL-17A基因m RNA。【研究结果】1.动物模型的建立(1)经TDI致敏激发后,TDI组10只小鼠均出现明显的喘息、呼吸急促、点头呼吸、弓背、前肢缩抬等哮喘症状,AOO组小鼠无明显上述症状。与AOO组相比,TDI组小鼠实验前、后体重差异无统计学意义(P>0.05)。(2)两组小鼠BALF中炎细胞计数、分类及涂片结果:与AOO组相比,TDI组小鼠BALF中白细胞总数、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞数目均明显升高,嗜中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比均明显升高,淋巴细胞百分比和单核细胞百分比均下降,差异均有统计学意义(P<0.05),与AOO组相比,TDI组BALF涂片中巨噬细胞、淋巴细胞所占的比例分别增加了4.6倍和4倍。(3)两组小鼠BALF中细胞因子IL-4、IFN-γ水平比较结果:与AOO组相比,TDI组小鼠BALF中IL-4和IFN-γ水平均显著升高(P<0.01)。(4)两组小鼠肺脏病理变化结果:AOO组小鼠肺组织内支气管腔未见渗出物,管壁及周围组织无炎细胞浸润,肺泡间隔未见增厚,无炎细胞浸润,肺泡腔内无渗出物;TDI组小鼠肺组织内支气管管壁破坏明显,管腔增厚,支气管管腔内以及肺泡腔内有大量的炎细胞浸润。2.TSLP表达及Th17/Treg细胞平衡在TDI哮喘中的变化及其相关基因启动子区甲基化改变模式(1)经TDI致敏激发后,TDI组16只小鼠均出现明显的喘息、呼吸急促、点头呼吸、弓背、前肢缩抬等哮喘症状,AOO组小鼠无明显上述症状。(2)两组小鼠BALF中炎细胞计数、分类结果:与AOO组相比,TDI组小鼠BALF中白细胞总数、中性粒细胞百分比、嗜酸性粒细胞百分比均升高,淋巴细胞百分比和单核细胞百分比均下降,差异均有统计学意义(P<0.01)。(3)两组小鼠气管、肺脏病理变化结果:AOO组小鼠气管管腔完整,无渗出物,未见炎细胞浸润,粘膜上皮细胞无变性坏死脱落;TDI组小鼠气管管腔变窄,管壁增厚,平滑肌增生,有大量炎细胞浸润,炎细胞呈团块状聚集,黏膜上皮细胞坏死脱落;AOO组肺组织内肺泡间隔未见增厚,无炎细胞浸润,肺泡腔内无渗出物。肺内支气管腔未见渗出物,管壁及周围组织无炎细胞浸润;TDI组小鼠肺泡间质出现充血和水肿。肺内支气管管腔内以及肺泡腔内有大量的炎细胞浸润,主要以嗜酸性粒细胞,中性粒细胞浸润为主。(4)两组小鼠肺组织中ROR-γt、IL-17A、Foxp3和TSLP基因m RNA表达水平比较:与AOO组相比,TDI组小鼠肺组织中Foxp3 m RNA相对表达水平下降,ROR-γt、IL-17A和TSLP的m RNA水平升高,差异均有统计学意义(P<0.01)。(5)两组小鼠肺组织Foxp3、ROR-γt、IL-17A和TSLP基因启动子区甲基化水平比较:与AOO组比较,TDI组小鼠肺组织中ROR-γt基因启动子区Cp G位点3、4、5、6、8、11和12的甲基化程度均下降(P<0.05),IL-17A基因启动子区Cp G位点6、7的甲基化程度均下降(P<0.01),Foxp3基因启动子区Cp G位点1和10的甲基化程度均升高(P<0.01),差异有统计学意义;未发现TDI组小鼠肺组织中TSLP基因启动子区Cp G位点发生明显改变。3.TSLP中和抗体干预对小鼠TDI哮喘的保护作用(1)经TDI致敏激发后,TDI组16只小鼠均出现明显的喘息、呼吸急促、点头呼吸、弓背、前肢缩抬等哮喘症状;TSLP中和组的哮喘症状比TDI组轻;AOO组小鼠无明显上述症状。(2)三组小鼠血清中Ig E和肺组织匀浆中IFN-γ、IL-4、IL-13的细胞因子水平测定结果:与AOO组相比,TSLP中和组血清中的Ig E、肺组织匀浆中IL-13均升高(Z=-2.324,-2.324)差异有统计学意义(P<0.05)肺组织匀浆中IFN-γ、IL-4差异无统计学意义(P>0.05);TDI组血清中的Ig E、肺组织匀浆中IFN-γ、IL-4、IL-13均升高(Z=-2.882,-2.882,-2.882,-2.882,)差异有统计学意义(P<0.05);与TSLP中和组相比,TDI组血清中的Ig E、肺组织匀浆中IFN-γ、IL-4、IL-13均升高(Z=-2.324,-2.324,-2.324,-2.324,)差异有统计学意义(P<0.05)。(3)三组小鼠气管、肺脏病理检查结果:AOO组小鼠气管管腔完整,无渗出物,未见炎细胞浸润,粘膜上皮细胞无变性坏死脱落;TDI组小鼠气管管腔变窄,管壁增厚,平滑肌增生,有大量炎细胞浸润,炎细胞呈团块状聚集,黏膜上皮细胞坏死脱落;相对于TDI组,TSLP中和组小鼠可显著改善气管周围的炎症浸润、平滑肌的增生;AOO组肺组织内肺泡间隔未见增厚,无炎细胞浸润,肺泡腔内无渗出物。肺内支气管腔未见渗出物,管壁及周围组织无炎细胞浸润;TDI组小鼠肺泡间质出现充血和水肿。肺内支气管管腔内以及肺泡腔内有大量的炎细胞浸润,主要以嗜酸性粒细胞,中性粒细胞浸润为主。TSLP中和组与TDI组相比,肺泡间质出现充血和水肿减轻,肺内支气管管腔内以及肺泡腔内有炎细胞的浸润程度减轻。(4)western blot检测三组小鼠肺脏TSLP的蛋白表达结果:与AOO组相比,TDI组小鼠TSLP水平相对表达量明显增高,中和抗体干预后TSLP水平较TDI组可明显下降。(5)三组小鼠肺组织中ROR-γt、IL-17A和Fox P3基因m RNA表达水平比较:与AOO组相比,TSLP中和组肺组织中ROR-γt、IL-17A基因m RNA水平升高(Z=-2.324,-2.324)差异有统计学意义(P<0.05),肺组织中Fox P3基因m RNA表达水平无统计学差异(P>0.05);TDI组肺组织中ROR-γt、IL-17A基因m RNA表达水平升高(Z=-2.882,-2.882)差异有统计学意义(P<0.01),肺组织中Fox P3基因m RNA表达水平无统计学差异(P>0.05);与TSLP中和组相比,TDI组肺组织中ROR-γt、IL-17A基因m RNA表达水平升高(Z=-2.324,-2.324)差异有统计学意义(P<0.05),肺组织中Fox P3基因m RNA表达水平无统计学差异(P>0.05)。【研究结论】1.利用气管滴注的激发方式改良了TDI哮喘小鼠模型,保证了TDI哮喘模型的稳定性和重复性。2.TSLP和Th17/Treg细胞失衡参与了TDI哮喘发病过程,ROR-γt、IL-17A和Foxp3基因启动子区域甲基化异常可能参与了Th17/Treg细胞失衡的调控。3.利用TSLP中和抗体干预后,小鼠哮喘症状发生明显缓解,并且干预组IL-17A及ROR-γt m RNA表达水平也比TDI哮喘组小鼠显著降低,表明TSLP可作为TDI哮喘治疗靶点,并且这种治疗作用可能通过抑制IL-17的表达发挥作用。