普鲁兰酶作为一种淀粉脱支酶可以高效催化普鲁兰糖、支链淀粉等底物中α-1,6-糖苷键的水解,在食品加工、生物能源、制药及化工等领域有广泛的应用。目前,尽管有很多研究集中于挖掘新的催化性能良好的普鲁兰酶,或对现有的普鲁兰酶进行分子改造以适应淀粉糖化工艺的条件。但是,理想的符合工业生产特性的普鲁兰酶,特别是可以用于淀粉冷水解工艺的普鲁兰酶非常少。随着淀粉水解技术的不断革新,淀粉深加工领域的不断拓展,筛选具备优良催化性能的普鲁兰酶对于优化生产工艺,降低生产成本,加强淀粉生物质资源的开发利用具有重要意义。本研究分析了嗜温菌Bacillus methanolicus PB1的基因组信息,找到一段候选普鲁兰酶基因（pul PB1）,在大肠杆菌中成功实现了该基因的异源表达,并研究了相关的酶学性质。依据生物信息学的手段对该普鲁兰酶（PulPB1）的氨基酸序列及结构组成进行分析,基于蛋白质工程技术研究其N末端结构域在酶分子催化过程中的作用,并通过定点突变技术对该普鲁兰酶进行分子改造,提高了热稳定性。主要研究结果如下:1.将Bacillus methanolicus PB1基因组中的普鲁兰酶基因克隆至载体p ET-28a,构建表达载体p ET-28a-PulPB1,并将其转化至大肠杆菌BL21（DE3）,成功表达出重组普鲁兰酶PulPB1。对诱导条件进行优化得到:在菌液OD₆₀₀值0.8时加入0.2 m M诱导剂IPTG,在20℃诱导16 h可以高效表达重组普鲁兰酶。经Ni离子亲和层析纯化后,得到电泳纯的普鲁兰酶,对普鲁兰糖的水解活性约292 U/mg。2.通过分析PulPB1的酶学性质,确定了它是一种冷适应型的Ⅰ型普鲁兰酶,可以选择性水解α-1,6-糖苷键;在30℃–50℃范围内具备高催化活性;最适p H 5.5,最适温度50℃,且50℃稳定性良好,半衰期达123 h。PulPB1对支链淀粉也展现出较强的水解能力,酶活达181 U/mg。此外,将PulPB1与葡萄糖苷酶共同用于40℃条件下支链淀粉的冷水解,效果较单酶水解体系显著提高。3.通过对PulPB1的N末端结构域进行改造研究发现,PulPB1的N末端缺失突变体在表达过程中大部分以包涵体的形式存在,酶活和稳定性明显降低,对普鲁兰糖的水解活性由292 U/mg降至141 U/mg,50℃半衰期由137 h降低至10 h;N末端置换突变体的催化活性较PulPB1提高27%,稳定性略微降低。分析确定,PulPB1的N末端为CBM68结构,该结构不仅影响酶分子的可溶性表达,结构的形成和保持,其与底物分子的结合也有一定关系,并因此影响催化活性和稳定性。4.通过半理性设计对PulPB1进行稳定性改造,构建包含26个突变体的文库,筛选得到稳定性提高的突变体M-（S243L）及M-（K253P）,对其进行组合突变得到M-（S243L-K253P）,其60℃半衰期达到107.8 min,是野生型普鲁兰酶的3.7倍。突变体结构分析表明,其稳定性提高是由于亮氨酸（L）的引入增强了局部疏水作用,脯氨酸（P）的引入增强了其所在loop环的刚性,两者共同作用增强了蛋白质分子的结构稳定性。