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牛乳是人们日常生活中比较普遍的蛋白质来源之一,同时也被WHO认定为人类食物过敏的八大类食品之一。酪蛋白(CN)、β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)被认为是牛乳中的主要过敏原,目前还没有一个可以有效治疗牛乳过敏的手段。而开展针对乳及乳制品主要过敏原酪蛋白(CN)、β-乳球蛋白(β-LG)和α-乳白蛋白(α-LA)的检测,能够为乳及乳制品过敏原标识标准的建立提供理论支撑和技术支持,也为易感特殊人群的健康提供保障。本论文主要研究了牛乳中三种主要过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备及性能鉴定、单克隆抗体的制备及性能鉴定、双抗夹心ELISA检测方法的建立及方法学评价。具体研究内容和结果如下:1、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定以牛乳主要过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂等量混合后,采用颈背部皮下注射的免疫方式对健康的新西兰大白兔进行免疫,制备的兔血清通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化分离后,分别采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度、间接ELISA法测定效价。结果表明,本研究成功制备高纯度抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗体;三种蛋白均进行了四次免疫,每次免疫的剂量为500μg/只,四免后测得三种多抗效价均达到1:729000。2、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白单克隆抗体的制备采用与兔多抗制备相同的免疫方式和免疫抗原对健康的适龄雌性BALB/c小鼠进行免疫,三种蛋白均进行了六次免疫,初免剂量均为100μg/只,加强免疫(2~6免)剂量均为50μg/只,冲刺免疫剂量为25μg/只,利用间接ELISA法检测小鼠免疫血清,选取六免血清效价最高的小鼠(酪蛋白效价为1:81000,α-乳白蛋白和β-乳球蛋白效价均为1:243000)。通过细胞融合和间接ELISA法检测筛选阳性孔,采用有限稀释法通过三次亚克隆后筛选分别得到2株(2A8、8B6)稳定分泌酪蛋白单抗的杂交瘤细胞株,8株(1C3、2F8、2H11、3A5、3A10、4A2、4A3、4B10)稳定分泌α-乳白蛋白单抗的杂交瘤细胞株,1株(2A8)稳定分泌β-乳球蛋白单抗的杂交瘤细胞株。采用体内腹水诱生法进行单克隆抗体的大量生产。3、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白单克隆抗体的鉴定通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对获得的腹水单抗进行纯化后,分别采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度、间接ELISA法测定效价、Westen-blotting鉴定特异性、非竞争性间接ELISA法检测亲和力。结果表明,α-乳白蛋白的2个单抗2H11和3A10效价偏低(1:27000),α-乳白蛋白其余6个单抗(1C3、2F8、3A5、4A2、4A3、4B10)、酪蛋白的2个(2A8、8B6)单抗以及β-乳球蛋白的1个(2A8)单抗的效价均可达到1:243000;酪蛋白单克隆抗体亲和力常数为3.1×10~7L/mol,α-乳白蛋白单克隆抗体亲和力常数为3.5×10~7 L/mol,β-乳球蛋白单克隆抗体亲和力常数为3.27×10~7 L/mol;商用单抗亚型试剂盒鉴定表明,α-乳白蛋白的3A10分泌的单抗亚型为IgG2b,α-乳白蛋白的其余细胞株、酪蛋白细胞株以及β-乳球蛋白细胞株分泌的单抗亚型均为IgG1。4、酪蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立通过对最佳捕获抗体的筛选、兔多抗和酶标二抗工作浓度优化,建立了酪蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,其中最佳捕获抗体为2A8,兔多抗最佳工作浓度为1:10000,HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)最佳工作浓度为1:10000。该方法建立的标准曲线线性范围为40~1280 ng/mL,最低检测限(limit of detetion,LOD)为40 ng/mL;该方法对酪蛋白检测的批内变异系数CV在2.72%~5.97%之间,批间变异系数CV在7.99%~12.33%之间,具有较高的精密度;该方法只与酪蛋白发生交叉反应,与牛乳中其他几种主要蛋白不发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法对酪蛋白的回收率为80.4%~92.25%,该方法具有较高的准确度,能够满足牛乳中酪蛋白过敏原的检测要求。5、α-乳白蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立通过对最佳捕获抗体的筛选、兔多抗和酶标二抗工作浓度优化,建立了α-乳白蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,其中最佳捕获抗体为4A2,兔多抗最佳工作浓度为1:15000,HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)最佳工作浓度为1:10000。该方法建立的标准曲线线性范围为2.5~40 ng/mL,LOD为2.5 ng/mL;该方法对α-乳白蛋白检测的批内变异系数CV在2.69%~6.27%之间,批间变异系数CV在8.06%~12.41%之间,具有较高的精密度;该方法只与α-乳白蛋白发生交叉反应,与牛乳中其他几种主要蛋白不发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法对α-乳白蛋白的回收率为84.6%~93.6%,该方法具有较高的准确度,能够满足牛乳中α-乳白蛋白过敏原的检测要求。6、β-乳球蛋白双抗夹心ELISA检测方法的建立通过对兔多抗和酶标二抗工作浓度优化,建立了β-乳球蛋白的双抗夹心ELISA检测方法,捕获抗体为2A8,兔多抗最佳工作浓度为1:10000,HRP标记的山羊抗兔IgG抗体(酶标二抗)最佳工作浓度为1:10000。该方法建立的标准曲线线性范围为12.5~200 ng/mL,LOD为12.5 ng/mL;该方法对酪蛋白检测的批内变异系数CV在3.33%~5.96%之间,批间变异系数CV在7.81%~12.36%之间,具有较高的精密度;该方法只与酪蛋白发生交叉反应,与牛乳中其他几种主要蛋白不发生交叉反应,具有较好的特异性;该方法对β-乳球蛋白的回收率为86.8%~92.3%,该方法具有较高的准确度,能够满足牛乳中β-乳球蛋白过敏原的检测要求。