枯草芽孢杆菌UJS0717产D-核糖发酵过程优化及动力学研究

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D-核糖又称D-呋喃核糖,是一种功能性的五碳糖,广泛存在于核糖核酸、NAD、NADP及FAD中,具有抗衰老、调节体内血糖/血脂等功能。D-核糖也是诸多药物或食品添加剂合成的中间体和平台化合物。国内外D-核糖的生产方法可以概括为三种:天然物质水解法,化学合成法以及微生物发酵法。其中,微生物发酵法是目前最经济、环境污染最小的D-核糖生产方法。本文首先建立了检测发酵液中D-核糖和葡萄糖的HPLC方法,进而对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)UJS0717摇瓶发酵、7L发酵罐中分批和半连续发酵生产D-核糖的过程进行了系统优化,并在此基础上构建了发酵生产D-核糖的动力学模型。  主要研究结果如下:  (1)以RID为检测器,建立了高效液相色谱法定量测定发酵液中葡萄糖和D-核糖的方法。该方法的测定条件为:柱型Shodex Suger SH1011,流动相为0.005 mol/L的稀硫酸溶液,柱温为50℃,进样量为10μL。底物葡萄糖和产物D-核糖的出峰时间分别为11.573 min和13.313 min。得到底物葡萄糖和产物D-核糖的回归方程分别为Y=6.8684X-0.0691和Y=6.5565X+0.0046,其中Y为葡萄糖或D-核糖的质量浓度,X为对应的峰面积。线性范围在2~45 g/L时,该法精密度、稳定性和重现性均良好;葡萄糖的平均回收率为99.27%,D-核糖的平均回收率为99.61%,RSD值分别为0.38%和0.14%,说明本方法准确可行。  (2)单因素摇瓶发酵试验结果证明,B.subtilis UJS0717发酵生产D-核糖的最佳温度为36℃,最佳接种体积为10%,最佳的培养基初始pH值为7.0,玉米淀粉水解液、玉米浆、(NH4)2SO4的最佳浓度分别为150 g/L、20 g/L和3.0 g/L。在单因素试验的基础上,采用Box-Behnken设计,应用响应曲面法优化了玉米淀粉水解液(以葡萄糖计)、玉米浆、(NH4)2SO4的浓度。优化的发酵培养基组成为:玉米淀粉水解液(以葡萄糖计)157 g/L,玉米浆21g/L,(NH4)2SO4浓度为3.2 g/L。在优化的发酵条件下,D-核糖理论产量为61.01g/L。通过试验验证所测值与理论预测值相近,表明该回归方程及响应面分析法可靠、有效。  (3)在7L发酵罐的分批发酵中,搅拌转速为600 rpm、通气量为1.4 vvm时最有利于D-核糖的生成,D-核糖的产量、产率和生产强度分别为67.24 g/L,0.43 g/g和1.60g/L.h;在半连续发酵过程中,以残糖浓度20 g/L左右为最佳补料时机,新鲜培养基2L为最佳补料体积及补加后玉米淀粉水解液(以葡萄糖计)为140 g/L左右时为最佳补料浓度,最终D-核糖的产率达到0.44 g/g,发酵强度达到2.33 g/L.h。  (4)在7L发酵罐上进行分批发酵试验,通过对发酵过程中的菌体干质量、D-核糖产量和残糖消耗量的测定,建立了描述D-核糖分批发酵的动力学模型,并对该模型进行了验证,结果显示该模型能基本描述发酵过程中菌体生长、产物生成和底物消耗的变化规律。
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