研究目的刺参是海参的一种,它对人体不仅有滋补的功能,而且还有医学和药理的功效,可以说,海参是一种常见的传统食品和民间药物。刺参多糖有许多独特的生物学和药理学活性,包括抗凝血、抗血栓形成、抗肿瘤和抗骨性关节炎等。临床试验已经证实刺参多糖对于患有缺血性中风和缺血性心肌炎的病人有很好的疗效。由此可以得出,刺参多糖是—种可以应用于治疗脑缺血再灌注损伤的潜在药物,但是其作用机理仍然不是很清楚。缺氧损伤已经涉及许多中枢神经系统(central nervous system, CNS)病理障碍,其中包括脑中风、头部外伤、肿瘤、血管畸形和神经退行性疾病。永久性脑血流量减少将会引发脑缺血再灌注损伤,这一损伤将会导致神经细胞的功能紊乱和不可逆性坏死,严重时甚至会导致机体的死亡。在通常情况下,再灌注被看作是一个不错的治疗方案,然而有时候它也会导致严重的脑损伤,例如：脑水肿、脑出血、神经血管损伤、神经坏死和炎症反应失控等等。到目前为止,还没有—个很好的方法用于治疗脑缺血,大量的研究表明脑缺血再灌注损伤与细胞凋亡有着密切的联系。缺氧／复氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)损伤是缺血、呼吸功能紊乱和肿瘤恶化等疾病的一个重要病理因素,此外,H/R损伤也能够诱发细胞损伤。帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)是存在于衰老个体当中第二大常见的神经退行性疾病,它极大影响着患者的生活质量。在病理状态下,PD是由黑质多巴胺能神经元损失所导致的运动功能障碍,其中包括动作迟缓,静止震颤,肌肉僵硬,步态障碍和姿势综合征。然而,PD的发病原因我们并不完全理解,但是我们认为氧化应激,细胞周期和炎症反应在PD中起着重要的作用。治疗PD的传统方法只能缓解症状,不能从根本上治愈神经退行性病变的过程。研究证实硫酸软骨素对于6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的神经损伤有明显的保护作用。研究也证实刺参多糖SJP具有神经保护的作用。SJP可以是一种治疗PD的潜在海洋药物,但是SJP发挥神经保护的细胞内信号通路机制仍然不是很清楚。尽管我们对脑中风病理发展过程的理解有了重大的进展,但是在脑血管疾病中的神经障碍发病机理仍然不是很清楚。越来越多的学者认为干细胞移植可以作为一个新的治疗方法用于脑中风。神经干细胞(neural stem cell, NSC)作为一类具有多分化潜能、自我更新能力的细胞,植入体内能够在损伤区域分化为成熟神经元和胶质细胞谱系,并与宿主神经有机整合,有效恢复亚急性期和慢性期损伤的神经功能。未分化的NSC在多种CNS疾病中都能够有效的促进脑损伤组织修复再生。细胞治疗是安全可行的,但是神经功能再生的机制不是很清楚。细胞治疗的优点主要依靠注入细胞的正确迁移和归巢。迁移是干细胞招募到特定区域的关键过程。基质细胞衍生因子-1α (stromal cell-derived factor 1 alpha, SDF-1α)和它的受体CXC趋化受体4(CXC chemokine receptor 4, CXCR4)在大脑CNS发展中起着很重要的作用,它能够在神经修复过程中调控迁移。SDF-1a能够在体内和体外促进神经前体细胞(neural precursor cell, NPC)迁移并定点到达局灶性脑缺血部位,脑外伤的损伤区域或者急性神经炎症的病理部位。SDF-1α/CXCR4轴能够促进NSC的迁移并使神经组织再生。SJP是从刺参体壁分离纯化得到的一种硫酸多糖。SJP能够促进神经球的迁移并呈浓度梯度。然而,SJP对于NSC迁移和归巢的细胞疗法仍然不是很清楚。本课题的研究目的是研究SIP增强SDF-1α/CXCR4轴促进NSC迁移的作用机制。研究方法1.验证SJP是否对Na2S2O4诱导的PC12细胞H/R损伤有保护作用。众所周知,神经嗜铬细胞瘤PC12细胞株具有交感神经元的表型和生理特性,因此,PC12通常用作建立神经元模型并进行神经系统疾病的研究。用Na2S2O4处理细胞会导致细胞缺氧,从而建立体外氧消耗的模型。刺参多糖SJP是刺参的主要生物活性成分之一。在我们的论文中,我们用PC12细胞来评价SJP对于Na2S2O4诱导H/R损伤的保护作用。在实验过程中,SJP对于Na2S2O4诱导PC12细胞H/R损伤的保护效果我们从以下几个方面进行检测。我们用MTT法检测Na2S2O4诱导PC12细胞H/R损伤的细胞存活率。用LDH, SOD和MDA检测法进一步分析SJP对PC12细胞H/R损伤的保护作用。为了确定SJP是否可以阻断Na2S2O4诱导PC12细胞凋亡,我们在荧光显微镜下观察Hoechst 33342/PI测定的细胞凋亡率。为了检测SJP对△ψm的影响,我们使用流式细胞仪检测JC-1的染色情况。SJP对于PC12细胞H/R损伤后的HIF-1α, cyto-c在胞浆和线粒体中的比率,Bax/Bcl-2比率,cl-casp-3/casp-3比率,p-p53和p53的影响是通过Western blot方法进行分析。为了进一步评估SJP是否通过MAPK信号通路来调节PC12细胞的H/R损伤,我们依旧用Western blot方法分析了在Na2S2O4诱导PC12细胞凋亡后的p-p38,p-JNK1/2和p-ERK1/2的表达情况cSB203580,SP600125和U0126是MAPK信号通路的三个特异性抑制剂,我们用它们进一步验证MAPK信号通路对Na2S2O4诱导PC12细胞H／R损伤的作用。2.验证SJP是否对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的PD损伤有保护作用。神经母细胞瘤SH-SY5Y是一个合适的模型,它可以用于研究PD疾病细胞生物化学的各个方面。6-OHDA是最广泛用于PD模型的神经毒害药物。因此,我们用6-OHDA处理SH-SY5Y细胞用于模拟PD的细胞模型。我们用倒置常光显微镜观察SJP保护6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的细胞形态学变化。用MDA检测法分析SJP对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞氧化应激的保护作用。我们用FACS法检测6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的细胞周期。我们用Western blot方法进行分析SJP对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤后的Cyclin D3和iNOS的影响。我们用Griess试剂检测6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤造成的NO释放量。为了进一步评估SJP是否通过抑制激活的NF-kB信号通路来调节6-OHDA对SH-SY5Y细胞造成的炎症损伤,我们依旧用Western blot方法分析SJP对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤后的p-p65, p65, p-lKB和IKB的蛋白表达情况。PDTC是NF-kB信号通路的特异性抑制剂,我们用它进一步验证NF-kB信号通路对6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的影响。3.验证SJP是否可以增强SDF-la/CXCR4轴促NSC迁移的作用。我们采用Transwell小室和神经球的链状迁移方法进行分析SJP和SDF-lot对于NSC迁移的影响。为了排除细胞增殖的影响,我们用CCK-8检测细胞存活率。为了排除药物毒性的影响,我们用Hoechst 33342/PI染色的方法检测细胞死亡率。Western blot检测手段检测Nestin, N-cadherin, TLR4, TNF-a, Cyclin Dl, EGFR, Alpha6integrin, MMP-2, MMP-9和iNOS以及SDF-la和CXCR4自身的表达量。为了进一步评估SJP和SDF-la二者是否通过PI3K/Akt/FOXO3a, MAPK和NF-kB信号通路来调节NSC的迁移,我们依旧用Western blot方法分析p-Akt, p-FOXO3a, p-38, p-ERK, p-JNK, p-p65, p65, p-lKB和IKB的蛋白表达情况。我们用AMD3100, LY294002, SB203580, U0126, SP6OO125和PDTC进一步验证PI3K/Akt/FOXO3a, MAPK和NF-kB信号通路对SJP和SDF-la促进NSC的迁移作用。实验结果1.SJP保护Na2S2O4诱导的PC12细胞H/R损伤。SJP能够有效的提高PC12细胞H/R损伤后的细胞存活率并且减低其导致的细胞外LDH释放。而且,SJP明显增加SOD活性并降低MDA水平。SJP能够有效提高H/R损伤诱导的△ψm损失。我们的实验结果显示SJP能够明显减低H/R损伤导致的细胞凋亡。SJP压制激活的MAPK信号通路,从而使Bax/Bcl-2比率和cl-casp-3/casp-3比率以及p-p53显著减低,也会降低cyto-c在胞浆和线粒体的比率。这种抑制细胞凋亡的现象呈现药物浓度的依赖性。SB203580和SP600125能进一步减低Bax/Bcl-2比率,cl-casp-3/casp-3比率,p-p53和cyto-c在胞浆和线粒体的比率。然而,U0126对这些变化并没有影响。MAPK信号通路与H/R损伤紧密相连。SJP能够抑制激活的p38和JNK MAPK,而对激活的ERK并没有影响。实验结果显示p38和JNK MAPK信号通路参与SJP调解缓解的PC12细胞H/R损伤。SJP处理组与H/R处理组相比,HIF-1a表达情况并没有区别。而且,SJP,SB203580, SP600125和U0126对p53的表达并没有影响。这说明SJP增强细胞存活和降低细胞凋亡并不是通过调节HIF-1α和p53来实现的。2.SJP保护6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞的PD损伤。实验结果显示SJP有效减弱6-OHDA所导致的：5H-SY5Y细胞形态学破坏。而且,SJP明显降低MDA水平。SJP对于6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞损伤的保护作用与细胞周期G1/S相关并能阻断Cyclin D3蛋白的表达。与此同时,SJP可以抵消激活的NF-kB信号通路并阻断上调的iNOS蛋白表达和NO的释放。我们的数据第一次证实SJP保护SH-SY5Y细胞免受6-OHDA损伤尽可能是与抑制NF-kB信号通路相关。3.SJP增强SDF-la/CXCR4轴促NSC迁移的作用。用SJP和SDF-la处理NSC可以增强细胞的迁移能力和促进神经球的细胞迁移并呈浓度依赖性。我们把SJP(20,40和80 μg/ml)加入到培养NSC的培养基中,与对照组相比,细胞存活率并没有明显差异。NSC加入SJP(20,40和80 μg/ml)没有明显的凋亡和坏死。SJP增强SDF-la/CXCR4轴促进NSC迁移的功能并伴随着Nestin, N-cadherin, TLR4, TNF-a, Cyclin Dl, EGFR, Alpha 6 integrin, MMP-2, MMP-9和iNOS以及SDF-la和CXCR4自身的上调。然而,这些上调的蛋白可以被AMD3100, LY294002, U0126和PDTC所阻断。相反,ICAM和MCP-1不受SJP和SDF-la以及AMD3100, LY294002, SB203580, U0126, SP600125和PDTC所影响。SJP能够增强SDF-la/CXCR4轴诱导分泌的MMP-2和MMP-9以及释放NO。实验结果显示SJP对SDF-la/CXCR4轴的增强作用并调节NSC的迁移主要是通过调节PI3K/Akt/FOXO3a, ERK/MAPK和NF-kB信号通路。结论以意义1.我们的实验结果显示SJP能够减少PC12细胞H/R损伤。这种保护效果可以修复神经元的功能,促使氧化应激趋于平衡并且显示抗凋亡的特性。SJP保护Na2S2O4诱导的PC12细胞H/R损伤是通过抑制激活的p38和JNK MAPK信号通路并减低Bax/Bcl-2比率,cl-casp-3/casp-3比率,p-p53激活和cyto-c在胞浆和线粒体的比率。SJP抑制PC12细胞的H/R损伤呈现剂量依赖性,这些说明SJP可以发展成为一种预防和治疗脑缺血再灌注损伤的新型药物。2.SJP能够保护SH-SY5Y细胞免受6-OHDA诱导的细胞形态学破坏。SJP可以抵御6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞产生的氧化应激和细胞周期,这一过程主要通过抑制激活NF-kB信号通路：NF-kB激活会使iNOS上调并导致NO的释放。因此,SJP是神经退行性疾病PD的一种备选药物。3.我们的实验结果显示SJP和SDF-1a处理NSC可以通过PI3K/Akt/FOXO3a, ERK/MAPK和NF-kB信号通路上调Nestin, N-cadherin, TLR4, TNF-a, Cyclin D1, EGFR, Alpha 6 integrin, MMP-2, MMP-9和iNOS以及SDF-1a和CXCR4自身。相反,不影响ICAM和MCP-1的表达量。SJP增强SDF-1a/CXCR4轴的MMP-2和MMP-9的分泌量以及NO的释放量。SJP可能成为细胞治疗脑损伤的潜在药物。