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研究背景骨肉瘤（Osteosarcoma）是一种起源于间叶组织的恶性肿瘤,仅次于浆细胞瘤在原发性骨肿瘤中占第二位,以能够产生骨样组织的梭形基质细胞为特征。多见于青少年,75%病例在10-20岁之间发病。1970年以前标准治疗是截骨术,大部分患者在两年内死于肺癌转移,5年生存率仅为10%-20%。近30年来,随着新辅助化疗广泛应用,骨肉瘤的5年生存率已大大提高。然而,尽管化疗在骨肉瘤治疗中具有举足轻重的地位并取得了可喜的成就,但是骨肉瘤化疗总体有效率仍徘徊在60%左右。因此,骨肉瘤治疗现在正处在一个新的阶段,必须寻找骨肉瘤标志物以判断其生物学特性和预后,并且要寻找临床治疗有效的分子靶向。葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein,GRP78）,又名免疫球蛋白重链结合蛋白（the immu—noglobulin heavy chain binding protein,Bip）,是主要的内质网伴侣蛋白,具有钙离子粘合性和抗凋亡的特性。近年来研究表明GRP78在某些肿瘤细胞中呈高表达,对于肿瘤细胞的抗化疗药物的性质及抗原表达有重要意义。一些研究表明,GRP78可以促进肿瘤细胞增殖和存活,提高肿瘤细胞的抗药耐药性,以及加速恶性肿瘤的转移。并且,GRP78还可以影响细胞凋亡途径或其他信号途径中的组成因子,比如阻止PKC-e/ERK/AP-1信号级联;抑制caspase-7和Bax活化。在实体肿瘤的微环境下,GRP78的应激产生可以对抗针对G1期和S期产生毒性的化学药物。并且还可以减少肿瘤细胞的凋亡,并且通过影响凋亡效应器的作用来阻断化学药物引起的细胞死亡。因此,GRP78可作为肿瘤生长和治疗效果的一个生物标记。近期的研究已经证实,在一些癌细胞中,将GRP78作为分子靶向可促进细胞凋亡,并且可克服癌细胞的抗药耐药性。钙网织蛋白（Calreticulin,CRT）也是一种内质网蛋白,具有一些独特的功能,比如伴侣蛋白活性和调节Ca2+。研究发现钙网织蛋白可增加Ca2+通过内质网的流动,却降低了线粒体Ca2+浓度并降低了膜电位。因此,Ca2+在内质网和线粒体两个细胞器之间的周转增加可能会损坏线粒体,这样可以增强癌细胞对凋亡信号刺激的感受性。另外的一些研究也表明,钙网织蛋白过表达的癌细胞对药物和放射诱发的细胞凋亡更加的敏感,而钙网织蛋白缺乏的癌细胞对紫外线诱导的细胞凋亡更具抵抗性。此外,钙网织蛋白过表达还可以阻止Akt信号转导、通过改变Ca2+稳态来调节p53功能,以调整放射诱发的细胞凋亡。尽管目前研究已经证实GRP78和Calreticulin在多种恶性肿瘤中的表达,并与肿瘤行为和治疗反应密切相关,但在人骨肉瘤细胞和骨肉瘤组织中,GRP78和Calreticulin是否也有相应的表达并与治疗反应有密切的关系,笔者尚未检索到相应的文献。本实验旨在研究GRP78和Calreticulin两种蛋白在人骨肉瘤组织中是否有表达,并比较骨肉瘤组织及正常组织表达的差异;化疗前后表达的差异;远隔转移及未转移之间的差异。依此来推断这两种蛋白在骨肉瘤组织中的表达与骨肉瘤生长、转移的关系以及化疗对其表达的影响。一、GRP78在人骨肉瘤组织中表达及其意义的实验研究目的尽管目前许多研究已经表明GRP78在许多恶性肿瘤中呈高表达,并与其恶性程度和侵袭力呈正相关,通过化疗可以使其表达降低。但目前还没有关于GRP78在人骨肉瘤组织中表达及其与转移、化疗药物之间关系的研究。本研究的目的为应用不同的实验方法来检测GRP78在人骨肉瘤组织中的表达,并比较骨肉瘤组织及正常组织表达的差异;化疗前后表达的差异;远隔转移及未转移之间的差异,并依此来推断这GRP78在骨肉瘤组织中的表达与骨肉瘤生长、转移的关系以及化疗对其表达的影响,以期能为骨肉瘤治疗和预后评估提供实验和理论依据。方法1免疫组织化学染色法检测GRP78在不同部位组织中的表达取骨肉瘤标本30例,其中未转移者5例,转移者25例;术前化疗者20例,术前未化疗者10例。每例标本同时取瘤体组织及正常组织作对照。取新鲜组织标本在-20℃下做冰冻切片进行免疫荧光染色。2 RT-PCR法检测GRP78在不同部位组织中的表达取新鲜组织碾碎后抽提组织总RNA,然后用RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。将电泳图移入图像分析系统进行表达强度测定。3 Western-Blot法检测GRP78在不同部位组织中的表达取新鲜标本碾碎提取蛋白质后进行Western-Blot。将胶片扫描入图像分析系统进行表达强度测定。结果1免疫组织化学染色法检测GRP78在不同部位组织中的表达组织细胞胞浆被染为绿色为阳性。GRP78主要存在于细胞内质网膜上染色深时为全胞浆绿色,浅时为类泡样胞浆绿染。GRP78的表达强度为瘤体组织＞瘤体周围正常组织;肿瘤转移组＞未转移组,术前未化疗组＞术前化疗组。瘤体周围正常组织和瘤体组织,肿瘤转移组和未转移组,术前未化疗组和术前化疗组表达量有显著差异。2 RT—PCR法检测GRP78在不同部位组织中的表达GRP78在所有标本中均有表达。GRP78的表达强度为瘤体组织＞瘤体周围正常组织,肿瘤转移组＞未转移组,术前未化疗组＞术前化疗组。瘤体周围正常组织和瘤体组织,肿瘤转移组和未转移组,术前未化疗组和术前化疗组表达量有显著差异。3 Westen-Blot法检测GRP78在不同部位组织中的表达GRP78在所有标本中都有表达。GRP78的表达强度为瘤体组织＞瘤体周围正常组织,肿瘤转移组＞未转移组,术前未化疗组＞术前化疗组。瘤体周围正常组织和瘤体组织,肿瘤转移组和未转移组,术前未化疗组和术前化疗组表达量有显著差异。二、Calreticulin在人骨肉瘤组织中表达及其意义的实验研究目的尽管目前许多研究已经表明Calreticulin在许多恶性肿瘤中表达,并与肿瘤生长和治疗反应有密切关系。但目前还没有关于Calreticulin在人骨肉瘤组织中表达及其与转移、化疗药物之间关系的研究。本研究的目的为应用不同的实验方法来检测Calreticulin在人骨肉瘤组织中的表达,并比较骨肉瘤组织及正常组织表达的差异;化疗前后表达的差异;远隔转移及未转移之间的差异,并依此来推断Calreticulin在骨肉瘤组织中的表达与骨肉瘤生长、转移的关系以及化疗对其表达的影响,以期能为骨肉瘤治疗和预后评估提供实验和理论依据。方法1免疫组织化学染色法检测Calreticulin在不同部位组织中的表达取骨肉瘤标本30例,其中未转移者5例,转移者25例;术前化疗者20例,术前未化疗者10例。每例标本同时取瘤体组织及正常组织作对照。取新鲜组织标本在-20℃下做冰冻切片进行免疫荧光染色。2 RT-PCR法检测Calreticulin在不同部位组织中的表达取新鲜组织碾碎后抽提组织总RNA,然后用RT-PCR试剂盒进行RT-PCR。将电泳图移入图像分析系统进行表达强度测定。3 Western-Blot法检测Calreticulin在不同部位组织中的表达取新鲜标本碾碎提取蛋白质后进行Western-Blot。将胶片扫描入图像分析系统进行表达强度测定。结果1免疫组织化学染色法检测Calreticulin在不同部位组织中的表达组织细胞胞浆被染为绿色为阳性。Calreticulin主要存在与内质网网腔内。染色为胞浆颗粒状绿染。绿色强度代表表达量。GRP78和Calreticulin在所有标本中都有表达。Calreticulin的表达强度为瘤体组织＜瘤体周围正常组织,肿瘤转移组＜未转移组,术前未化疗组＜术前化疗组。瘤体周围正常组织和瘤体组织,肿瘤转移组和未转移组,术前未化疗组和术前化疗组表达量有显著差异。2 RT—PCR法检测Calreticulin在不同部位组织中的表达Calreticulin在所有标本中均有表达。Calreticulin的表达强度为瘤体组织＜瘤体周围正常组织,肿瘤转移组＜未转移组,术前未化疗组＜术前化疗组。瘤体周围正常组织和瘤体组织,肿瘤转移组和未转移组,术前未化疗组和术前化疗组表达量有显著差异。3 Westen-Blot法检测Calreticulin在不同部位组织中的表达Calreticulin在所有标本中都有表达。Calreticulin的表达强度为瘤体组织＜瘤体周围正常组织,肿瘤转移组＜未转移组,术前未化疗组＜术前化疗组。瘤体周围正常组织和瘤体组织,肿瘤转移组和未转移组,术前未化疗组和术前化疗组表达量有显著差异。结论本课题首次在人骨肉瘤组织中检测到GRP78和Calreticulin的表达,并运用免疫组织化学染色法、RT-PCR法和Western-Blot法比较了骨肉瘤是否转移和是否经过化疗后GRP78和Calreticulin的表达变化。结果发现GRP78的表达骨肉瘤组织高于正常组织,发生转移患者的表达高于未转移患者,未化疗者高于化疗者。而Calreticulin的表达则相反。本研究表明,GRP78可刺激肿瘤增殖、存活、转移,并且对化疗药物治疗有相应的反应。而Calreticulin的过表达可使骨肉瘤患者对化疗药物的治疗更加敏感。因此,GRP78和Calreticulin可作为骨肉瘤行为和治疗反应的分子靶向标记,在临床工作中也可应用GRP78和Calreticulin作为判断骨肉瘤发展和预后的生物标记。而应用基因手段抑制GRP78或提高Calreticulin的表达可能抑制骨肉瘤细胞的生长、增加骨肉瘤细胞对化疗药物的敏感性,控制其转移并改善预后。抑制GRP78表达或提高Calreticulin表达的联合治疗可能代表根除残留骨肉瘤的新方法。因此,利用GRP78或Calreticulin作为分子靶点或介质进行骨肉瘤基因治疗具有广泛的应用前景。