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第一部分乳腺癌组织芯片中moesin的表达及其临床病理意义目的：检测膜突蛋白(moesin)在乳腺癌组织芯片中的表达情况，探讨其与临床病理参数之间的关系；分析3株乳腺癌细胞系中moesin的表达，为后续moesin相关体外实验提供基础。方法：采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase，SP)对乳腺癌组织芯片上110例乳腺癌组织、30例乳腺癌癌旁组织、10例正常乳腺组织中moesin的表达进行检测，分析moesin的表达同临床病理资料之间的关系；逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)及免疫印迹(Western Blot)检测乳腺癌细胞株MCF-7／S、MCF-7／ADR、MDA-MB-231中moesin mRNA和蛋白的表达含量。结果：①moesin在30例乳腺癌组织、30例相应癌旁组织和10例正常乳腺组织中的异常阳性表达率分别为60．00％，16．67％，0．00％，乳腺癌组织中moesin异常阳性表达高于癌旁组织(χ~2=11．9，p＜0．05)及正常乳腺组织(χ~2=8．61，p＜0．05)。②在80例乳腺癌组织中，moesin异常阳性表达与患者年龄、分化程度无明显关系，与肿瘤大小(χ~2=13．84，p＜0．05)、雌激素受体(estrogen receptor，ER)表达阴性(χ~2=17．67，p＜0．05)、孕激素受体(progesterone receptor，PR)表达阴性(χ~2=9．21，p＜0．05)及淋巴结转移阳性(χ~2=6．01，p＜0．05)有关。③RT-PCR、real-time quantitative PCR及WB结果显示，moesin mRNA和蛋白在3株乳腺癌细胞中表达水平存在差异，MCF-7／ADR、MDA-MB-231表达高于MCF-7／S。结论：moesin在乳腺癌中的表达同ER受体状态有关，并在乳腺癌发生、发展、侵袭转移过程中发挥作用。第二部分靶向moesin RNAi慢病毒表达载体的构建与鉴定及其对乳腺癌细胞基因沉默效应研究目的：设计并构建针对moesin的RNA干扰(RNA interference，RNAi)慢病毒表达载体，并对其在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和DMCF-7／ADR中基因沉默效果进行检测。方法：设计合成三对针对moesin基因不同位点的短发夹RNA(short hairpinRNA，shRNA)编码序列，再克隆至pGCSIL-GFP载体上，采用测序法鉴定寡核苷酸序列，构建的3条重组shRNA慢病毒表达载体命名为pGCSIL-GFP_moesin-TARGET 1／2／3。在293T细胞中进行病毒包装和滴度测定。慢病毒感染乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7／ADR，实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)及免疫印迹(Western Blot)在核酸和蛋白水平上检测RNAi慢病毒对moesin表达的抑制效果。结果：成功构建了针对moesin基因三个不同位点的RNAi慢病毒表达载体，经PCR和测序鉴定与实验设计合成的moesin靶基因序列完全一致。在293T细胞中进行病毒包装可获得满足实验要求的病毒滴度。在适当感染条件下，两株乳腺癌细胞系的感染率均可达到80％以上。感染MDA-MB-231细胞后，real-timequantitative PCR结果显示pGCSIL-GFP_moesin-TARGET 1／2／3均可产生较好的干扰效果，以pGCSIL-GFP_moesin-TARGET 1效果最佳。采用real-time quantitativePCR和Western Blot在MDA-MB-231和MCF-7/ADR中进行验证，结果证实moesin在核酸和蛋白水平上表达被沉默。结论：靶向moesin的RNAi慢病毒表达载体构建成功，慢病毒RNA干扰细胞感染效率高、基因沉默效果稳定，为进一步在体外实验中探讨moesin在乳腺癌恶性生物学行为中的作用奠定了基础。第三部分慢病毒介导moesin基因沉默对乳腺癌细胞生物学行为影响的体外研究目的：研究RNA干扰moesin表达后对人乳腺癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、体外侵袭能力、耐药能力的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：慢病毒感染细胞后，分别针对MDA-MB-231和MCF-7／ADR，绘制正常对照组(Control，CON)、阴性对照组(Negative control，NC)、RNAi靶点病毒感染组(Knock down，KD)细胞增殖曲线；流式细胞仪检测CON、NC、KD组细胞周期，real-time quantitative法检测细胞周期相关基因cyclin D1表达水平；流式细胞仪检测CON、NC、KD组细胞凋亡；0．3μg／ml表柔比星处理MCF-7／ADR细胞后观察CON、NC、KD组细胞周期和细胞凋亡变化情况；Transwell侵袭小室实验检测MDA-MB-231细胞侵袭能力变化，免疫印迹(Western Blot)法检测CD44v6、基质金属蛋白酶-7(MMP-7)和E-钙黏蛋白(E-cadherin)的表达；MTT法检测MCF-7／ADR细胞耐药能力的变化，Western Blot法检测p-糖蛋白(p-glycoprotein，p-gp)的表达；real-time quantitative PCR法检测moesin相关信号通路分子Rho A，Rac1，Akt1 mRNA表达水平，Western Blot法检测Akt1及磷酸化Akt1蛋白表达水平。结果：①对moesin基因进行RNA干扰后，有效靶点对细胞增殖产生抑制作用(P＜0．05)，流式细胞周期结果显示，KD组G0／G1期细胞比例增加，S期细胞比例减少(P＜0．05)，KD组细胞cyclin D1 mRNA表达水平明显降低(P＜0．05)；②RNA干扰moesin的表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡情况未产生明显影响(P＞0．05)；③0．3μg／ml表柔比星处理MCF-7／ADR后使KD组G0／G1期细胞比例增加、S期细胞比例减少，细胞晚期凋亡比例增加(P＜0．05)；④Transwell小室检测MDA-MB-231细胞侵袭能力，结果显示KD组细胞穿膜侵袭能力明显降低，同时KD组中与侵袭转移能力相关的CD44v6、MMP-7蛋白水平明显下降，而E-cadherin蛋白水平升高(P＜0．05)；⑤RNA干扰后MCF-7／ADR细胞KD组表柔比星半数抑制浓度为24．105±1．93μg/ml，与CON组表柔比星半数抑制浓度51．158±0．92μg/ml相比明显降低，相对逆转率达到53．3％(P＜0．05)；对p-gp蛋白进行检测发现KD组该蛋白表达水平明显降低(P＜0．05)；⑥RNA干扰moesin后两株细胞中Rho A、Rac1 mRNA表达水平明显降低(P＜0．05)，而Akt1 mRNA表达水平无明显变化(P＞0．05)，虽然Akt1基因表达水平未见明显变化、但其磷酸化蛋白表达水平降低(P＜0．05)。结论：RNA干扰moesin后，可以通过降低Rho A、Rac1基因表达水平下调cyclin D1基因，抑制细胞G1期→S期转换；通过下调p-gp蛋白表达水平影响MCF-7／ADR耐药能力，使细胞不再适应原有培养环境，出现细胞增殖抑制和凋亡改变；可以通过下调CD44v6、MMP-7蛋白表达水平，上调E-cadherin蛋白表达水平影响细胞侵袭转移能力；上述作用有可能是通过下调Rho A、Rac1表达水平及Akt1磷酸化水平而实现的。