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目的：
转录本序列长度在大于200个核苷酸以上的非编码RNA通常被称为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)且占了大多数。大量研究表明，lncRNA不仅有着作为肺癌早期诊断及预后标志物的潜能，而且lncRNA在肺癌的癌性过程及转移，耐药等方面发挥着重要作用。所以，探究lncRNA在肺癌发生发展中的作用机制，将为肺癌的预防和精准治疗提供新角度和新靶点。本课题组前期发现miR-33a-5p负向调控其靶基因Twsit相关蛋白1(Twsit Family BHLH Transcription Factor1,Twist1)并通过Twsit1介导的上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)影响非小细胞肺癌的体内转移，以及miR-33a-5p可作为肺癌的早期诊断标志物。同时，通过结合基因芯片和生物信息学来筛选在肺癌中差异表达且与miR-33a-5p具有潜在结合靶点的lncRNAs时，发现lncRNA JPX与miR-33a-5p有潜在结合位点。但是，新发现的lncRNA JPX在肺癌发生过程中的作用尚不清楚。因此，我们提出了lncRNA JPX可能通过miR-33a-5p-Twist1调节轴进而影响下游Wnt/β-catenin信号通路来参与EMT进程并影响肺癌生长和转移的研究假说。本研究拟通过lncRNA JPX-miR-33a-5p-Twist1轴介导的癌性信号通路阐明影响肺癌发生发展的分子机制。
方法：
（1）通过lncRNA芯片分析4对肺癌患者标本的lncRNA表达谱，并通过生物信息学预测与miR-33a-5p具有潜在结合靶点的lncRNA。将数据库预测结果与芯片数据相结合，筛选出目的lncRNA。
（2）通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测在肺癌组织及相应癌旁组织和肺癌细胞中目的lncRNA，miR-33a-5p，Twist1的表达量。并分析目的lncRNA与miR-33a-5p，Twist1及临床病理因素之间的相关性。
（3）经过核质分离实验了解目的lncRNA的核质分布情况。
（4）分别设计合成目的lncRNA的小干扰RNA，miR-33a-5p mimics及相对应的阴性对照和构建目的lncRNA的过表达质粒，并在肺癌细胞中验证转染效果。
（5）应用双荧光素酶报告基因实验验证目的lncRNA与miR-33a-5p之间的靶点关系。
（6）通过CCK-8和细胞克隆形成实验分析目的lncRNA对肺癌细胞生长和增殖的影响。
（7）通过细胞划痕和Transwell实验分析目的lncRNA对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。
（8）裸鼠皮下成瘤实验分析目的lncRNA在体内对肺癌细胞生长的影响。
（9）通过蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测目的lncRNA对Twist1，EMT标志物和Wnt/β-catenin信号通路中蛋白质水平的影响。
结果：
（1）通过分析康成生物lncRNA芯片结果结合starBase数据库预测与miR-33a-5p具有潜在结合靶点的61条lncRNAs，仅筛选出一条lncRNA JPX。
（2）lncRNA JPX和Twist1在肺癌临床标本中的表达要高于相应癌旁组织且在肺癌细胞中相对高表达，miR-33a-5p的相对表达量则相反，lncRNA JPX的表达与Twist1的表达呈正相关，与miR-33a-5p的表达呈负相关，lncRNA JPX的表达与肿瘤大小和TNM分期相关。
（3）核质分离实验证明lncRNA JPX主要位于细胞质中。双荧光素酶报告基因实验也进一步验证了lncRNA JPX与miR-33a-5p之间存在靶点关系。
（4）分别敲低和过表达lncRNA JPX可分别抑制和促进肺癌细胞的生长和增殖；且过表达lncRNA JPX可恢复由miR-33a-5p造成的对肺癌细胞生长和增殖抑制的影响。
（5）分别敲低和过表达lncRNA JPX可分别抑制和促进肺癌细胞的迁移和侵袭；且过表达lncRNA JPX可恢复由miR-33a-5p造成的对肺癌细胞迁移和侵袭抑制的影响。
（6）裸鼠皮下成瘤实验发现过表达lncRNA JPX可促进裸鼠皮下肿瘤的生长。
（7）Western Blot证明敲低lncRNA JPX可增加E-cadherin和GSK-3β蛋白质水平的表达，减少了Twist1，N-cadherin，Vimentin和β-catenin蛋白质水平的表达；过表达lncRNA JPX可增加Twist1，N-cadherin，Vimentin和β-catenin蛋白质水平的表达，减少了E-cadherin和GSK-3β蛋白质水平的表达；过表达miR-33a-5p对E-cadherin和GSK-3β蛋白质水平的增加和对Twist1，N-cadherin，Vimentin和β-catenin蛋白质水平的减少可由共转染lncRNA JPX质粒后恢复。
结论：
研究发现，与配对的癌旁组织相比lncRNA JPX和Twist1在肺癌组织中显著高表达，miR-33a-5p在肺癌组织中显著低表达，且lncRNA JPX的表达与miR-33a-5p的表达呈现负相关，与Twist1的表达呈现正相关。同时结合临床病理资料发现，lncRNA JPX与肿瘤大小和TNM分期有关且具有统计学意义。在细胞实验中，通过CCK-8和细胞克隆形成实验证明lncRNA JPX可促进肺癌细胞的生长和增殖；通过细胞划痕和Transwell实验证明lncRNA JPX可促进肺癌细胞的迁移和侵袭。在分子机制上，我们发现lncRNA JPX通过miR-33a-5p作为Twist1的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）影响肺癌的EMT进程及相关蛋白表达。在动物体内中，裸鼠皮下注射过表达lncRNA JPX的稳定肺癌细胞株的成瘤能力要高于注射空质粒组。同时，我们还发现调节lncRNA JPX的表达可改变GSK-3β和β-catenin蛋白质水平的表达，这说明lncRNA JPX有可能通过Wnt/β-catenin信号通路来参与EMT进程。
转录本序列长度在大于200个核苷酸以上的非编码RNA通常被称为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)且占了大多数。大量研究表明，lncRNA不仅有着作为肺癌早期诊断及预后标志物的潜能，而且lncRNA在肺癌的癌性过程及转移，耐药等方面发挥着重要作用。所以，探究lncRNA在肺癌发生发展中的作用机制，将为肺癌的预防和精准治疗提供新角度和新靶点。本课题组前期发现miR-33a-5p负向调控其靶基因Twsit相关蛋白1(Twsit Family BHLH Transcription Factor1,Twist1)并通过Twsit1介导的上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)影响非小细胞肺癌的体内转移，以及miR-33a-5p可作为肺癌的早期诊断标志物。同时，通过结合基因芯片和生物信息学来筛选在肺癌中差异表达且与miR-33a-5p具有潜在结合靶点的lncRNAs时，发现lncRNA JPX与miR-33a-5p有潜在结合位点。但是，新发现的lncRNA JPX在肺癌发生过程中的作用尚不清楚。因此，我们提出了lncRNA JPX可能通过miR-33a-5p-Twist1调节轴进而影响下游Wnt/β-catenin信号通路来参与EMT进程并影响肺癌生长和转移的研究假说。本研究拟通过lncRNA JPX-miR-33a-5p-Twist1轴介导的癌性信号通路阐明影响肺癌发生发展的分子机制。
方法：
（1）通过lncRNA芯片分析4对肺癌患者标本的lncRNA表达谱，并通过生物信息学预测与miR-33a-5p具有潜在结合靶点的lncRNA。将数据库预测结果与芯片数据相结合，筛选出目的lncRNA。
（2）通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别检测在肺癌组织及相应癌旁组织和肺癌细胞中目的lncRNA，miR-33a-5p，Twist1的表达量。并分析目的lncRNA与miR-33a-5p，Twist1及临床病理因素之间的相关性。
（3）经过核质分离实验了解目的lncRNA的核质分布情况。
（4）分别设计合成目的lncRNA的小干扰RNA，miR-33a-5p mimics及相对应的阴性对照和构建目的lncRNA的过表达质粒，并在肺癌细胞中验证转染效果。
（5）应用双荧光素酶报告基因实验验证目的lncRNA与miR-33a-5p之间的靶点关系。
（6）通过CCK-8和细胞克隆形成实验分析目的lncRNA对肺癌细胞生长和增殖的影响。
（7）通过细胞划痕和Transwell实验分析目的lncRNA对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。
（8）裸鼠皮下成瘤实验分析目的lncRNA在体内对肺癌细胞生长的影响。
（9）通过蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测目的lncRNA对Twist1，EMT标志物和Wnt/β-catenin信号通路中蛋白质水平的影响。
结果：
（1）通过分析康成生物lncRNA芯片结果结合starBase数据库预测与miR-33a-5p具有潜在结合靶点的61条lncRNAs，仅筛选出一条lncRNA JPX。
（2）lncRNA JPX和Twist1在肺癌临床标本中的表达要高于相应癌旁组织且在肺癌细胞中相对高表达，miR-33a-5p的相对表达量则相反，lncRNA JPX的表达与Twist1的表达呈正相关，与miR-33a-5p的表达呈负相关，lncRNA JPX的表达与肿瘤大小和TNM分期相关。
（3）核质分离实验证明lncRNA JPX主要位于细胞质中。双荧光素酶报告基因实验也进一步验证了lncRNA JPX与miR-33a-5p之间存在靶点关系。
（4）分别敲低和过表达lncRNA JPX可分别抑制和促进肺癌细胞的生长和增殖；且过表达lncRNA JPX可恢复由miR-33a-5p造成的对肺癌细胞生长和增殖抑制的影响。
（5）分别敲低和过表达lncRNA JPX可分别抑制和促进肺癌细胞的迁移和侵袭；且过表达lncRNA JPX可恢复由miR-33a-5p造成的对肺癌细胞迁移和侵袭抑制的影响。
（6）裸鼠皮下成瘤实验发现过表达lncRNA JPX可促进裸鼠皮下肿瘤的生长。
（7）Western Blot证明敲低lncRNA JPX可增加E-cadherin和GSK-3β蛋白质水平的表达，减少了Twist1，N-cadherin，Vimentin和β-catenin蛋白质水平的表达；过表达lncRNA JPX可增加Twist1，N-cadherin，Vimentin和β-catenin蛋白质水平的表达，减少了E-cadherin和GSK-3β蛋白质水平的表达；过表达miR-33a-5p对E-cadherin和GSK-3β蛋白质水平的增加和对Twist1，N-cadherin，Vimentin和β-catenin蛋白质水平的减少可由共转染lncRNA JPX质粒后恢复。
结论：
研究发现，与配对的癌旁组织相比lncRNA JPX和Twist1在肺癌组织中显著高表达，miR-33a-5p在肺癌组织中显著低表达，且lncRNA JPX的表达与miR-33a-5p的表达呈现负相关，与Twist1的表达呈现正相关。同时结合临床病理资料发现，lncRNA JPX与肿瘤大小和TNM分期有关且具有统计学意义。在细胞实验中，通过CCK-8和细胞克隆形成实验证明lncRNA JPX可促进肺癌细胞的生长和增殖；通过细胞划痕和Transwell实验证明lncRNA JPX可促进肺癌细胞的迁移和侵袭。在分子机制上，我们发现lncRNA JPX通过miR-33a-5p作为Twist1的竞争性内源RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）影响肺癌的EMT进程及相关蛋白表达。在动物体内中，裸鼠皮下注射过表达lncRNA JPX的稳定肺癌细胞株的成瘤能力要高于注射空质粒组。同时，我们还发现调节lncRNA JPX的表达可改变GSK-3β和β-catenin蛋白质水平的表达，这说明lncRNA JPX有可能通过Wnt/β-catenin信号通路来参与EMT进程。