【摘 要】
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目的:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一类血液系统恶性增殖性疾病,其中复发难治性急性髓系白血病（refractory acute myeloid leukemia,RAML）的预后较差,寻找其发生的分子机制,进一步发现该类疾病的潜在治疗靶点十分重要。可变剪接（alternative splicing,AS）异常与AML预后关系密切。本研究通过生物信息学分析T
【基金项目】
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山西省回国留学人员科研资助项目“BCL2L11可变剪接在难治性急性髓系白血病中的作用机制研究（编号:2020-076）”；
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目的:急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）是一类血液系统恶性增殖性疾病,其中复发难治性急性髓系白血病（refractory acute myeloid leukemia,RAML）的预后较差,寻找其发生的分子机制,进一步发现该类疾病的潜在治疗靶点十分重要。可变剪接（alternative splicing,AS）异常与AML预后关系密切。本研究通过生物信息学分析TCGA-AML数据,获得RNA剪接模式、AML表达谱及相关临床信息,构建可变剪接网络,识别与生存相关的可变剪接因子以及可变剪接事件涉及的基因,并分析可变剪接事件与AML发生及预后的相关性。检测临床样本中预后相关剪接因子SRSF1的表达水平,同时检测SRSF1与其靶基因BCL2L11对细胞生物学功能的影响,旨在阐明RAML发病分子机制,为探索RAML潜在治疗靶点奠定理论基础。方法:1.利用生物信息学获取并整合分析TCGA中AML的AS数据首先从TCGA与TCGA Splice Seq数据库中获取患者数据,再根据Percentage of Samples with PSI Value>75%,临床OS>30等标准筛选并进行研究分析;其次按照NMP1突变与否进行分组并采用R 3.5.1软件识别分析两组患者的异常AS事件;然后通过Cox回归分析识别生存相关AS事件与AS事件独立预后相关基因;同时使用David工具进行预后相关基因的GO富集分析,Cytoscape 3.6.1构建基因互作网络图;最后构建AS预后模型并找到AML预后相关的剪接因子。2.q PCR检测RAML临床骨髓样本中SRSF1表达收集治疗后预后良好的AML患者与RAML患者骨髓样本各30例,使用Trizol法从骨髓标本中提取RNA,采用实时定量PCR（q PCR）技术检测两组样本SRSF1表达情况。3.SRSF1与BCL2L11不同剪接体对细胞增殖凋亡的影响首先构建SRSF1、BCL2L11-γ剪接体及BCL2L11-L剪接体的表达载体,使用Lipofectamine 2000转入细胞中;SRSF1过表达后通过CCK 8检测细胞增殖,流式细胞技术检测细胞凋亡;RT-PCR检测SRSF1过表达后BCL2L11-L和γ两种剪接体表达水平;最后通过CCK 8、高内涵分析系统及流式细胞术检测BCL2L11不同剪接体对细胞增殖、凋亡的影响。结果:1.从TCGA与TCGA Splice Seq数据库中最终筛选出了129名AML患者进行了AS事件的研究分析;发现在AML中,AS事件的普遍性及主要事件类型是外显子跳跃（ES）;找到了BCL2L11、CASP3等239个预后相关基因;构建多个剪接预后模型并提示:AS发生较高群体的预后明显较差;同时找到了预后相关剪接因子SRSF1、RBM4等;其中,SRSF1高表达和RBM4低表达与AML预后不良有关。2.RAML骨髓样本与预后良好AML骨髓样本的q PCR结果表明,RAML组SRSF1表达显著升高,P<0.05。3.SRSF1过表达促进BCL2L11-γ剪接体的形成,进而阻滞细胞凋亡,P<0.05;CCK 8实验和细胞凋亡实验结果表明:与对照组相比,高表达BCL2L11-γ剪接体后,细胞的增殖、凋亡均无明显差异,P>0.05,而高表达BCL2L11-L剪接体的细胞增殖明显下降,凋亡增加,P<0.05。结论:1.在急性髓系白血病中存在7种可变剪接事件,其中ES最多见,涉及的基因主要富集在细胞周期、有丝分裂检查点以及DNA完整性检查点等生物学过程中。可变剪接事件与AML预后相关,剪接因子SRSF1高表达与预后不良相关,而RBM4低表达与预后不良相关。2.复发性难治性急性髓系白血病患者中SRSF1表达升高。3.BCL2L11是SRSF1的重要靶基因,SRSF1过表达引起BCL2L11异常可变剪接,促进BCL2L11-γ剪接体形成,γ剪接体可能通过抑制细胞凋亡,在AML耐药及进展中发挥作用。
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