GABA能神经元是纹状体中数量上占比最大的一类神经元,作为一种抑制性神经元,在成体动物的大脑内参与了神经再生过程。有文献报道,在卒中后小鼠的康复期内,抑制纹状体神经元的活性,可以促进神经再生并改善行为学功能。然而,GABA能神经元在卒中后的亚急性期对小鼠的康复发挥着什么样的作用,且其作用的机理又是什么,并不清楚。本课题采用光基因的方法并结合GAD2-Arch-GFP和GAD2-ChR2-tdTomato两种转基因小鼠,特异性地调控卒中后纹状体GABA能神经元的活性,探究其活性对小鼠卒中后的神经功能康复的影响及其作用机制。1.本课题运用GAD2-Arch-GFP和GAD2-ChR2-tdTomato两种转基因小鼠,用530纳米的绿光和473纳米的蓝光分别刺激GABA能神经元上特异性表达的光敏感通道蛋白Arch和ChR2,从而实现对GABA能神经元活性的抑制和激活,达到特异性调控其活性的目的。为了证明激光确实可调控纹状体GABA能神经元的活性,在第一章中,我们在光刺激的同时,也记录了神经元的电活动。发现在GAD2-Arch-GFP转基因小鼠中,无论是从局部场电位还是神经元的放电频率,530纳米的绿光刺激确实降低了神经元的活性,且刺激过程中信号的能量也显著低于刺激前和刺激停止后的信号能量。而在GAD2-ChR2-tdTomato转基因小鼠中,473纳米的蓝光也可以诱发神经元放电,蓝光刺激过程中的神经元放电频率显著高于刺激前及刺激后的放电频率。最后,我们还通过免疫荧光染色的方法,进一步确认光刺激的细胞是GABA能神经元。至此我们证明了530纳米绿光及473纳米蓝光确实可调控纹状体GABA能神经元的活性。2.在第二章中,我们在脑缺血后一周开始光刺激,每天两次,每次15分钟,共7天。在卒中之前的一天及卒中后的第1,3,7,14天,进行神经功能评分来评估卒中小鼠神经功能的康复。结果显示,跟对照组相比,抑制纹状体GABA能神经元的活性可改善卒中后神经功能的康复,且减少了脑萎缩体积(p<0.05)。而兴奋纹状体GABA能神经元的活性反而加重了缺血后的脑损伤,并相比对照组有更大的脑萎缩体积。旷场实验也证明了抑制纹状体GABA能神经元的活性可重建卒中后小鼠的运动功能。3.在第三章中,我们主要通过免疫组化的方法检测脑水肿、血管密度和细胞形态学的改变,来探究光抑制纹状体GABA能神经元活性促进卒中后神经功能康复的原因。我们从神经再生及神经保护两个方面分别进行探讨。结果显示,在抑制组中并没有检测到明显的神经再生现象,而是发现,相比对照组,抑制纹状体GABA能神经元的活性促进了梗死边缘区CD31~+的微血管的密度并显著降低了梗死边缘区TUNEL~+的细胞数目(p<0.05),而兴奋纹状体GABA能神经元得到了相反的结果。4.为了进一步探讨抑制纹状体GABA能神经元的活性促进血管密度增加的机制,在第四章中我们检测了与血管生长密切相关的一些营养因子的表达,包括bFGF,VEGF,PDGF及BDNF。PCR结果发现相比对照组而言,抑制组中唯独bFGF的表达得到了显著上调,且兴奋纹状体GABA能神经元还降低了bFGF的表达。Western blot检测及免疫荧光染色结果进一步验证了抑制组中梗死边缘区bFGF的上调(p<0.05),且在兴奋组中出现了梗死边缘区bFGF的下调。染色共定位结果显示,绝大多数的bFGF都共定位在血管内皮上,提示光刺激后梗死边缘区增多的bFGF主要是由血管内皮细胞分泌而来。5.为了研究清楚GABA能神经元的活性如何影响bFGF表达的升高,我们设计了离体实验,包括神经元/星形胶质细胞/血管内皮细胞、神经元/星形胶质细胞、神经元/内皮细胞三种不同的体外共培养体系。530纳米绿光抑制纹状体GABA能神经元的活性唯独在三细胞共培养体系中上调了bFGF的表达,但类似的现象并没有在神经元/星形胶质细胞或星形胶质细胞/血管内皮细胞的双细胞共培养体系中发现。此外,从绿色光刺激过的三种细胞培养体系中收集的条件培液可以保护糖氧剥夺模型损伤后的另一组三细胞共培养体系的细胞活性,进一步提示抑制GABA能神经元的活性对卒中后神经功能的改善及脑萎缩体积的减少可能是光刺激后上调的bFGF发挥的神经保护作用的结果。综上所述,我们对GABA能神经元活性如何影响卒中后神经功能的康复及其作用机制进行了深入的研究。结果显示抑制纹状体GABA能神经元的活性可以促进卒中后小鼠神经功能的改善并减少脑萎缩体积,而这些保护作用可能与抑制GABA能神经元活性促进血管内皮细胞上调的营养因子bFGF有关,而且这种调控依赖于星形胶质细胞的存在。进一步揭示了神经血管单元在信号调控及神经功能调控中发挥了重要的作用,也为后期脑卒中的临床应用提供了新的思路及理论依据。