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羊踯躅 Rhododendron molle(Blume)G.Don 属杜鹃花属羊踯躅亚属植物,是一种黄色观赏花卉,具有非常重要的药用价值。目前研究人员在庐山植物园发现了其红色的品种。本研究旨在研究羊踯躅黄花和红花相关基因表达的差异,为杜鹃花等花卉的花色调控寻找分子依据。
提取羊踯躅黄花和红花两个材料的总RNA,利用mRNA差异显示(differential display PCR,DDRT-PCR)技术,经反转录后以随机引物L1-L8与锚定引物R1-R3配合进行PCR扩增。本论文对RNA的提取方法进行了有效的改良并对DDRT-PCR反应体系及扩增程序的退火温度进行优化,筛选得到一套适于羊踯躅花瓣DDRT-PCR分析的参数因子组合,然后将扩增的PCR产物经6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,银染染色后可观察到十余条清晰的差异条带。它们绝大部分在150bp到1000bp之间,将这些差异条带进行第二次PCR扩增,回收纯化。其中只有四条可以得到单一条带(E08、H06、A07和E06),将它们与pMD18-T载体进行连接,经蓝自斑筛选后进行测序。结果通过GenBank数据库进行同源性比对,发现其中E08与编码丁酸激酶的基因相似性达83%,H06与莽草酸转运蛋白的编码基因有87%的相似性,A07与编码融合蛋白的基因有83%的相似性。根据各个序列的同源基因的功能推测,E08、H06和A07三个片段可能与羊踯躅花色素苷的代谢途径有关。而E06与已知序列的同源性很低,所以推测可能是新基因,其编码的蛋白质可能与羊踯躅红花和黄花的差异表达有关。本实验将为研究影响花色相关基因在花瓣中的表达提供科学的参考依据并对我们用基因工程的手段改变花色具有重要意义。