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研究背景和目的:化疗是肿瘤治疗广泛应用的手段之一,而化疗耐药是目前肿瘤治疗面临的一大难题,肿瘤耐药原因多种多样,机制仍然不清楚。人端粒酶(telomerase)是具有逆转录酶活性的核糖核酸酶,其中hTERT是最重要的催化亚单位。端粒酶以自身RNA为模板,合成端粒重复序列,从而维持染色体结构完整性及稳定性。端粒酶在生殖细胞、胚胎干细胞、肿瘤细胞核内高表达,而在正常体细胞中的活性被抑制,端粒酶可以填补DNA复制的缺陷,减少端粒在细胞分裂过程中的损耗,与肿瘤细胞无限增殖潜能密切相关。hTERT高表达与肿瘤细胞生物学行为密切相关,影响疾病的发展和预后。以往大多数有关hTERT研究主要集中于其细胞核内发挥逆转录酶活性维持端粒长度,在肿瘤细胞增殖、侵袭、转移及化疗耐药中的作用,而其非逆转录酶活性作用亦越来引起关注。研究发现,即便缺失其逆转录酶功能hTERT仍可促进细胞抗凋亡、DNA损伤修复,并参与干性维持和基因表达调控。亦有研究表明,hTERT可在线粒体定位序列引导下进入线粒体,与线粒体DNA(mtDNA)结合,影响mtDNA的稳定性。本课题组前期已发表研究表明随着肝癌细胞耐药能力的增加,线粒体hTERT表达亦逐渐增多,表明线粒体hTERT与肝癌细胞耐药密切相关,但机制不明。因此,阐明hTERT线粒体转位在肝癌细胞耐药中的作用,丰富hTERT在肝癌化疗耐药中的分子机制,将为肝癌治疗提供新的方法。方法:第一部分:端粒酶逆转录酶(hTERT)非逆转录酶活性影响肝癌细胞耐药的研究1、野生型hTERT(WThTERT)慢病毒转染细胞后,CCK-8法检测肝癌细胞化疗敏感性变化;2、将端粒酶活性缺失的DNhTERT(D711A且V712I)慢病毒转染细胞,TRAP实验检测端粒酶活性变化,CCK-8法检测端粒酶逆转录酶活性缺失对细胞耐药的影响;3、Western Blot及免疫荧光实验检测DNhTERT转染细胞后线粒体hTERT的表达及定位变化;4、构建肝癌耐药细胞株,Western Blot及免疫荧光实验检测耐药细胞中线粒体hTERT的表达情况;5、活细胞染色、流式细胞术、Western Blot检测耐药细胞干性相关特征变化情况;6、在端粒酶活性缺失的基础上(D711A且V712I)构建线粒体定位序列突变(MPEAPECRAVRSLLRSHYRE)的hTERT(NUChTERT)慢病毒转染细胞,Western Blot及免疫荧光实验检测线粒体hTERT的表达情况,CCK-8法检测NUChTERT对细胞耐药的影响;7、活细胞染色、萤光素酶实验、Western Blot实验检测NUChTERT对细胞线粒体膜电位(Δψm)、ROS、ATP、OCT-4干性相关指标的影响;第二部分线粒体hTERT通过抑制线粒体呼吸链复合物活性影响肝癌细胞耐药的研究1、比色法检测DNhTERT对肝癌细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性的影响;2、比色法检测NUChTERT对肝癌细胞线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性的影响;结果:第一部分:端粒酶逆转录酶(hTERT)非逆转录酶活性影响肝癌细胞耐药的研究1、Huh7细胞转染WThTERT后,对化疗药物顺铂(CDDP)的抵抗增强。2、Huh7细胞转染DNhTERT后,仍然可以促进细胞对CDDP的抵抗。3、Huh7和U2OS细胞转染DNhTERT后,Western Blot实验发现线粒体hTERT表达增加,免疫荧光实验证实hTERT线粒体定位增多。4、构建HepG2、Huh7对CDDP的耐药细胞株,分别为HepG2/CDDP、Huh7/C2DDP,CCK-8实验检测细胞耐药指数明显升高,Western Blot实验检测分别与亲本细胞相比,耐药细胞线粒体hTERT表达增加,免疫荧光实验发现耐药细胞hTERT线粒体定位增多。5、使用TMRE(四甲基罗丹明乙酯)活细胞探针孵育亲本细胞HepG2、Huh7及耐药细胞HepG2/CDDP、Huh7/CDDP,激光共聚焦显微镜观察与亲本细胞相比,耐药细胞Δψm明显升高。流式细胞术检测发现与亲本细胞相比,耐药细胞干细胞表面marker CD133、Ep CAM阳性细胞比例增加。Western Blot证实与亲本细胞相比,耐药细胞干性相关因子OCT-4表达增加。6、Huh7细胞转染NUChTERT后,Western Blot实验与免疫荧光证实与DNhTERT细胞相比,NUChTERT线粒体表达明显降低,CCK-8法发现与DNhTERT细胞相比,NUChTERT对CDDP抵抗能力降低。7、使用活细胞探针TMRE、MitoSox孵育Huh7-control、Huh7-DNhTERT、Huh7-NUChTERT细胞后,激光共聚焦显微镜观察发现Huh7-DNhTERT细胞Δψm升高,ROS降低,萤光素酶实验发现ATP水平降低,Western Blot实验表明细胞干性相关因子OCT-4表达升高,而Huh7-NUChTERT细胞上述效应明显减弱。第二部分线粒体hTERT影响线粒体呼吸链复合物活性导致肝癌细胞耐药的研究1、Huh7细胞转染DNhTERT后,比色法检测线粒体呼吸链复合物活性发现,与对照细胞相比,DNhTERT转染细胞呼吸链复合物Ⅰ活性显著降低,而对呼吸链复合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性无明显影响。2、Huh7细胞转染NUChTERT后,比色法检测发现NUChTERT可部分回复DNhTERT所导致的线粒体呼吸链复合物Ⅰ活性的降低。研究结论:1、hTERT非逆转录酶活性亦参与了肝癌细胞化疗耐药;2、hTERT线粒体转位是肝癌细胞化疗耐药的重要原因;3、线粒体hTERT可通过抑制呼吸链复合物Ⅰ活性,抑制ROS、ATP生成,促进细胞干性化,最终导致肝癌细胞化疗耐药;综上所述,hTERT可在线粒体定位序列引导下定位于线粒体,通过抑制呼吸链复合物Ⅰ活性,从而抑制ROS、ATP生成,促进细胞干性化,最终导致肝癌细胞化疗耐药。