【摘 要】
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小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的一种具有高度危害性的传染病,主要侵害小反刍类动物。自2007年在我国西藏阿里地区首次发现小反刍兽疫疫情至今,全国已经先后有23个省份地区上报出现小反刍兽疫疫情,该病为国内畜牧业带来了严重的危害和难以估量的经济损失。通过NCBI已公布的PPRV参考毒株Nigeria75/1株的N基因核苷酸
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小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）引起的一种具有高度危害性的传染病,主要侵害小反刍类动物。自2007年在我国西藏阿里地区首次发现小反刍兽疫疫情至今,全国已经先后有23个省份地区上报出现小反刍兽疫疫情,该病为国内畜牧业带来了严重的危害和难以估量的经济损失。通过NCBI已公布的PPRV参考毒株Nigeria75/1株的N基因核苷酸序列,设计一对引物扩增PPRV N基因1578bp,将扩增的片段插入p MD-19-T载体,构建克隆载体p MD-19-T-N。经测序正确后,将其转化至感受态细胞DH5α中,选择酶切位点Eco R I和Sac I,将鉴定正确的酶切产物连接至表达载体p ET-32a（+）中,构建原核表达载体命名为p ET-32a-N。p ET-32a-N载体经转化,28℃、6h诱导表达后,进行SDS-PAGE鉴定,并对蛋白进行纯化、复性后,Western blot分析。结果表明PPRV N基因获得表达,且表达的重组N蛋白为可溶性蛋白,并有良好的免疫原性。使用原核表达的重组PPRV N蛋白作为包被抗原,建立小反刍兽疫病毒ELISA检测方法。首先运用棋盘法对包被抗原浓度和血清稀释度进行优化,确定最适包被抗原浓度为4.86μg/m L、血清稀释度1:800;通过工作条件优化,确定抗原包被条件4℃16h、封闭时间37℃60min、一抗血清孵育条件37℃40min、酶标二抗孵育时间37℃40min、二抗稀释度1:1000、TMB显色时间8min。接着运用优化后的工作条件,进行批内批间重复性试验,重复性良好。最后检测了ORFV阳性血清,验证间接ELISA方法对其他血清的特异性好。应用建立的ELISA检测方法,对安徽省天长、滁州、池州、亳州、固镇、巢湖、肥西等部分羊场的血清样品共94份进行检测,检测PPRV抗体阳性率为86.4%。其检测结果与法国ID.vet公司ID Screen?PPR Competition ELISA试剂盒同批次进行抗体检测比对,符合率达96.0%。综上所述,本研究应用原核表达的PPRV N蛋白,建立的间接ELISA检测方法,特异、敏感、重复性好。为我省小反刍兽疫抗体检测和免疫效果评价提供了可参考的检测方法。
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