论文部分内容阅读
目的:聚多巴胺(polydopamine,PDA)是一种可以对任何材料进行表面功能化的黏合性聚合物,具有超强的粘附性和良好的生物相容性,并且可以充当二次反应的平台,在基材表面引入各种活性分子,从而改善界面相容性,亲水性及潜在的化学反应性。基于其独特的表面改性功能,本研究旨在探究:构建PDA涂层纤维蛋白胶(fibrin glue,FG)表面锚定音猬因子(sonic hedeghog,SHH)的复合支架,并探究该复合支架对大鼠神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的生长及分化的影响,为用于脊髓损伤修复提供新思路。方法:(1)按FG材料表面处理情况,将实验分为3组:FG空白对照组(FG表面未经处理)、FG-PD组(FG表面经过PDA涂覆处理)和FG-PD-SHH组(FG经PDA修饰后表面嫁接有SHH);首先制作纤维蛋白胶,并经过冷冻抽真空干燥得到FG支架,然后利用PDA自然黏合的特性制备FG-PD支架,最后将FG-PD支架作为二次修饰平台嫁接活性因子SHH得到FG-PD-SHH支架。采用扫描电子显微镜分别观察三组支架微观结构以及使用ELISA测量FG-PD支架对SHH黏附性能,以及FG-PD-SHH支架SHH缓释效果。(2)取健康SD孕鼠(孕14~15 d)腹中胎鼠脑组织,利用悬浮培养法在体外分离、培养大鼠NSCs并扩增传代,取第三代细胞种植于复合支架上培养,使用免疫荧光方法测量大鼠NSCs表面标志物。(3)观察复合支架对大鼠NSCs生长与分化的影响;取第三代大鼠NSCs,镜下观察聚集成球后分别种植于FG支架(对照组)、FG-PD支架(PDA涂层)、FG-PD-SHH支架(PDA及SHH涂层)上,利用血清神经元培养基培养。通过MTT法测试复合支架对大鼠NSCs增殖活力的影响;共同培养14 d后,采用扫描电子显微镜分别观察三组支架表面大鼠NSCs生长情况,利用免疫荧光法分别检测神经细胞相关蛋白:生长再生相关蛋白(Growth associated protein-43,GAP43)、髓磷脂碱性蛋白(Myelin basic protein,MBP)以及胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP),并利用免疫印迹方法测定神经细胞相关蛋白表达水平。(4)挑选60只体健的SD大鼠,用来构建脊髓横断模型,并随机分为四组:单纯脊髓横断组(SCI),单纯FG支架移植组(FG),PDA涂层FG支架移植组(FG-PD),SHH涂覆FG-PD支架移植组(FG-PD-SHH)。术后观察四组大鼠后肢运动功能并且每周进行BBB评分。结果:(1)扫描电子显微镜显示:20mg/ml FG支架镜下呈海绵型网状结构,多巴胺颗粒铺层于网状结构以及SHH微粒黏附在表面;ELISA结果显示FG-PD支架具有较强的SHH黏附性,在24 h内SHH的交联率较高;同时复合支架FG-PD-SHH对SHH具有良好的缓释性能,持续缓释,平缓且持续时间较长,可维持在19 d左右,且形成比较稳定。(2)体外培养的大鼠NSCs镜下观察从大量的悬浮单细胞聚集成球,具有良好的透光度,并且高表达nestin。(3)MTT显示FG-PD-SHH支架可以促进大鼠NSCs增殖;扫描电子显微镜显示FG-PD-SHH组大鼠NSCs生长分化最为明显,向四周辐射状生长的丝状突起数量最多,密度最高。免疫荧光和Western-blot结果显示:与FG组和FG-PD组相比,FG-PD-SHH组支架高表达神经细胞相关蛋白GAP43、MBP而低表达GFAP(P<0.05)。(4)从第2周到第12周,FG、FG-PD、FG-PD-SHH三组的大鼠BBB评分一直高于SCI组,同时FG-PD-SHH组BBB评分在四组中上升最明显(P<0.05)。结论:制备的SHH修饰PDA涂层纤维蛋白支架具有良好的SHH黏附及缓释效果;该复合支架可促进大鼠体外NSCs增殖与分化,并且促进大鼠体内脊髓损伤的修复。