研究背景及目的:肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是一种对人类健康危害极大的恶性肿瘤,每年约有六十万人被诊断为肝癌患者,每年的死亡人数超过25万且呈现逐年上升的现象。根据2018年的统计数据显示,HCC的发病率和死亡率在所有癌症类型中分别位居第六位和第四位,排名十分靠前。研究发现,相较于传统的肝癌治疗方法,索拉非尼（sorafenib）能够有效提高HCC患者的整体疗效及生存率,但在治疗数月后常有耐药现象的产生。原发性和继发性耐药问题的产生极大降低了药物治疗的有效性,影响整体的治疗效果。研究表明,耐药的发生涉及很多发生机制,包括细胞自噬现象、肿瘤干细胞的产生、以及对肿瘤存活重要的微环境、表观遗传等。但索拉非尼在HCC患者中的耐药机制尚未完全阐明,亟待深入探讨。circular RNA（circRNA）是近年来发现的共价闭合环状内源非编码RNA,通常情况下这种非编码RNA在正常组织或细胞中表达丰度十分低或没有表达,但在癌组织和癌细胞中则呈现高表达的现象,因此目前研究发现认为circRNA有望成为一种新的肿瘤标志物或肿瘤有效治疗靶点。circRNA与传统的线性mRNA不同,一般的真核生物线性mRNA在其线性的5’末端与3’末端分别包含有帽子结构以及多聚腺苷尾巴结构,特异的环形构象使得circRNA序列十分保守,结构十分稳定,能够在特定的细胞类型或细胞生长的特定阶段发挥重要功能。绝大多数的circRNA位于胞浆,通常情况下,circRNA上包含有许多miRNA的结合位点,因此circRNA可以通过与miRNA的结合影响miRNA功能的发挥,以此实现对其下游基因的调控。部分位于胞核中的circRNA主要通过与RNA结合蛋白相结合来实现对其下游靶基因的调节。研究发现,circRNA表达失调与多种疾病及细胞功能改变相关。miRNA是一种含有20个核苷酸左右的结构简单的非编码RNA,大部分miRNA可以影响多个靶基因的表达活性以及功能发挥,但是近年来也发现部分miRNA可以针对性的调节一个基因。虽然miRNA的功能已有大量报道,但miRNA通过与circRNA相互作用来调节特定生物学过程的相关研究仍然处于探索之中。已有研究表明,circRNA与索拉非尼耐药性的产生密切相关。本研究着重探索circPHKB在HCC细胞中对索拉非尼敏感性的影响。结果显示,索拉非尼处理后的HCC细胞circPHKB的表达升高,circPHKB表达量的升高在一定程度上降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性,因此circPHKB可能是HCC细胞中一种新的增敏索拉非尼的潜在靶点。研究内容及研究方法:第一部分circPHKB表达上调降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性1、筛选出索拉非尼处理后HCC细胞中差异性表达的circRNA2、索拉非尼处理HCC细胞中circPHKB表达变化分析3、circPHKB环化位点的测序分析4、发散型与聚合型引物对circPHKB的扩增分析5、circPHKB稳定性的实验验证6、circPHKB在HCC细胞中的分布研究7、沉默circPHKB后索拉非尼对HCC细胞存活、凋亡的影响研究第二部分索拉非尼促进HCC细胞中circPHKB表达上调的机制研究1、circPHKB结合蛋白的生物信息学预测2、验证circPHKB与e IF4A3的相互作用3、索拉非尼处理后HCC细胞中e IF4A3表达变化研究4、沉默e IF4A3对HCC细胞中circPHKB表达的影响5、沉默e IF4A3联合索拉非尼处理HCC细胞对circPHKB表达的影响第三部分circPHKB通过调节miR-1234-3p/CYP2W1信号通路降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性1、circPHKB结合miRNA的生物信息学预测2、索拉非尼处理后HCC细胞中miRNA表达变化研究3、circPHKB对miR-1234-3p的吸附作用机制研究4、沉默或过表达miR-1234-3p后索拉非尼对HCC细胞存活、凋亡影响的研究5、生物信息学的预测以及验证miR-1234-3p所调控的下游靶蛋白6、索拉非尼处理后HCC细胞中CYP2W1表达变化研究7、miR-1234-3p对CYP2W1的调控机制研究8、沉默CYP2W1后索拉非尼对HCC细胞存活、凋亡影响的研究9、circPHKB调控miR-1234-3p/CYP2W1信号通路的研究根据以上研究内容所涉及到的主要研究方法包括:1、HCC细胞系Hep G2细胞和Huh7细胞体外培养和传代2、蛋白印记检测蛋白在细胞中表达的变化3、瞬时转染技术改变细胞内靶基因的蛋白表达水平4、CCK-8检测细胞存活情况5、运用在线软件及数据库对靶分子进行生物信息学分析预测6、双荧光素酶报告基因实验检测circRNA与miRNA以及miRNA与mRNA之间的相互结合的作用7、FISH实验以及细胞的核质分离实验检测circRNA在胞中的分布8、一代测序检测circRNA环化位点的位置9、PCR琼脂糖凝胶电泳验证不同的类型的引物扩增circRNA的结果10、放线菌素D检测circRNA以及mRNA的稳定性11、RT-q PCR检测细胞中circRNA、miRNA以及mRNA的表达变化12、流式细胞术检测细胞凋亡情况研究结果第一部分circPHKB的表达上调降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性1、索拉非尼处理的HCC细胞中筛选发现有三种circRNA的表达发生差异性变化2、索拉非尼处理HCC细胞后circPHKB表达量显著增加3、circPHKB由外显子环化形成,其环化位点位于3号与8号外显子之间4、发散型引物只能在c DNA中扩增出DNA片段5、circPHKB的稳定性显著高于其线性基因PHKB mRNA的稳定性6、circPHKB主要分布于HCC细胞的细胞质中7、沉默circPHKB可增强HCC细胞对索拉非尼的敏感性第二部分索拉非尼促进HCC细胞中circPHKB表达上调的机制研究1、生物信息学分析表明,e IF4A3与PHKB Pre-mRNA存在相互作用2、e IF4A3与PHKB Pre-mRNA存在三个结合位点3、索拉非尼处理HCC细胞后e IF4A3表达显著升高4、沉默e IF4A3可抑制circPHKB的表达5、沉默e IF4A3能够抑制索拉非尼诱导的circPHKB表达上调第三部分circPHKB通过调节miR-1234-3p/CYP2W1信号通路降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性1、生物信息学分析发现circPHKB可能与四种miRNA有结合作用2、索拉非尼处理后miR-1234-3p表达显著下降3、circPHKB与miR-1234-3p能够直接结合4、沉默miR-1234-3p降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性,而过表达miR-1234-3p提升HCC细胞对索拉非尼的敏感性5、生物信息学分析发现miR-1234-3p对CYP2W1存在调控作用6、miR-1234-3p能够与CYP2W1 3’UTR区直接结合7、沉默miR-1234-3p可使CYP2W1蛋白表达上调,而过表达miR-1234-3p可使CYP2W1蛋白表达下调8、过表达miR-1234-3p可抑制索拉非尼诱导的CYP2W1蛋白表达上调9、沉默CYP2W1后显著提升HCC细胞对索拉非尼的敏感性10、敲低circPHKB后CYP2W1表达显著下调;敲低circPHKB可抑制索拉非尼诱导的CYP2W1表达上调11、同时抑制circPHKB与miR-1234-3p可显著上调CYP2W1的表达,也可促进索拉非尼对CYP2W1表达的上调作用结论1、发现并验证了circPHKB的存在,circPHKB的表达上调降低HCC细胞对索拉非尼的敏感性2、e IF4A3促进HCC细胞中circPHKB的表达上调3、circPHKB通过调节miR-1234-3p/CYP2W1信号通路改变HCC细胞对索拉非尼的敏感性