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背景与目的1989年在德国首次发现超广谱β-内酰胺酶（Extended spectrum beta-lactamases ESBL）。近年来,在第三、四代头孢菌素以及新型广谱β-内酰胺类抗菌药物的广泛应用所造成的抗性选择压力下,CTX-M型ESBL在临床的检出率日趋增高,已替代SHV型和TEM型,成为医院和社区获得性感染中最常见的ESBL型别。CTX-M型ESBL在全球范围呈现快速传播趋势,目前在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等至少26种细菌的菌株中均检出有CTX-M型ESBL。CTX-M-65基因属于CTX-M-9组,和CTX-M-14相较,有两个位点的突变,即丙氨酸（GCC）80?缬氨酸（GTC）和丝氨酸（AGC）275?精氨酸（CGC）。自2007年于中国某医院一弗氏柠檬酸杆菌分离株中首次发现CTX-M-65型ESBL后,十年间,blaCTX-M-65已在中国、韩国、美国等多个国家快速流行传播,宿主菌涉及大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和沙门氏菌等多种菌属,感染宿主涵盖人、家禽、野生动植物、水源等,存在于人类和动物日常生活的各个领域,严重威胁公共卫生安全,妨碍畜牧业的发展。因此,对CTX-M-65基因分布、传播机制及基因环境的研究,可以明确其基因定位,从而有效控制其转移,遏制其扩散和传播,临床意义与社会价值显著。BlaCTX-M基因超过大半定位于质粒上,少部分存在于染色体上。耐药基因的定位和菌株的型别具有一定联系。BlaCTX-M基因定位于质粒上遗传稳定性较差,反之,存在于染色体上时,具有良好的遗传稳定性。BlaCTX-M基因通过质粒进行水平传播,接合性质粒可以介导其在同种或不同种属细菌之间转移、传播,促使耐药菌株剧增,严重时导致泛耐药菌株的爆发和流行。Bla CTX-M基因周围的可移动遗传序列,如blaCTX-M上游的插入序列ISEcpI、IS26和下游的插入序列IS903、ORF477等,对其表达和转移等产生非常关键的调控作用,上述可移动元件单独或同时参与耐药基因的表达与调控。本课题组的前期研究中,在河南地区首次从肺炎克雷伯菌中检出blaCTX-M-65,但是本地其它菌种菌株中是否有blaCTX-M-65的流行,blaCTX-M-65上下游基因结构及转移播散能力,以及流行菌株间是否具有关联均不清楚。为解决上述问题,我们进行该课题研究,拟通过统计分析所收集的临床标本,明确河南地区携blaCTX-M-65菌株的分布、流行情况;通过blaCTX-M-65的基因定位以及高通量测序,探明其基因环境;通过质粒转移接合实验,分析blaCTX-M-65的播散机制;通过多位点序列分型技术,研究携bla CTX-M-65菌株的遗传异质性,目的是为临床控制携blaCTX-M-65菌株所致感染提供科学的指导。方法1.菌株鉴定及药敏分析收集2016年9月-2017年1月郑州大学第一附属医院检验科细菌室分离的,来源于痰液（含肺泡灌洗液）、分泌物（含脓液）、血液、尿液、粪便以及各种引流液等标本,对第三代头孢菌素耐药的革兰阴性杆菌。所有实验菌株均用VITEKⅡCOMPACT微生物全自动鉴定分析仪鉴定到种。药敏结果依据2016年CLSI标准判读。2.ESBL初筛和确证试验严格按照CLSI 2014年标准,进行可疑菌株ESBL初筛和确证实验。3.BlaCTX-M-65在细菌中的定位研究和基因环境分析PCR扩增blaCTX-M-9组基因,并将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后,置于UVP凝胶成像分析仪下分析,初步筛选出blaCTX-M-65基因阳性菌株。提取初筛阳性菌株的质粒基因,通过PCR扩增后,测序,明确blaCTX-M-65基因在细菌中的定位,探明blaCTX-M-65的基因环境。4.菌株的质粒转移接合试验通过质粒转移接合试验,分析携blaCTX-M-65基因质粒的可转移性。5.菌株的同源性分析通过多位点序列分型（MLST）技术,对携blaCTX-M-65基因的菌株进行遗传异质性分析。结果1.CTX-M-65型ESBL在革兰阴性杆菌的分布测序结果显示,在收集的369株耐三代头孢菌素的革兰阴性杆菌中,279株肠杆菌科细菌中12株携blaCTX-M-65基因,其中10株肺炎克雷伯菌、2株大肠埃希菌。在90株非发酵菌中未检出blaCTX-M-65基因。2.ESBL初筛和表型确证试验12株携blaCTX-M-65菌株的ESBL确证试验均表现为阴性。3.BlaCTX-M-65的基因定位和基因环境分析所有菌株的blaCTX-M-65基因定位于质粒上。BlaCTX-M-65基因上下游基因元件扩增测序结果显示,其上游主要为插入序列ISEcp1和IS26,下游均为插入序列IS903。共检出四种不同种类的基因组件。组件一:IS26-?ISEcp1-472bp-blaCTX-M-65-?IS903;组件二,IS26-?ISEcp1-42bp-blaCTX-M-65-?IS903;组件三,IS26-?ISEcp1-66bp-blaCTX-M-65-?IS903;组件四,blaCTX-M-65-?IS903。4.质粒转移接合试验8个双抗麦康凯平板上接合子均生长,供体菌、受体菌均不生长。通过提取接合子质粒DNA,经PCR扩增后测序结果进行局部序列比对法BLAST,blaCTX-M-65基因标准序列相似度100%。5.MLST分型结果共获得4种不同的ST型别。10株肺炎克雷伯菌的MLST分型结果为ST11和ST258,主要为ST11（8/10）。2株大肠埃希菌MLST分型结果为ST117和ST4360,分别来自呼吸科和新生儿科。结论1.河南地区CTX-M-65型ESBL在革兰阴性杆菌中具有很高的流行率,且携blaCTX-M-65菌株均为多重耐药菌株。2.所有分离菌株携带blaCTX-M-65基因定位于质粒上。BlaCTX-M-65基因上游主要为插入序列ISEcp1和IS26,下游均为插入序列IS903。3.可接合性质粒及blaCTX-M-65周围的插入序列ISEcp1、IS903等遗传元件参与blaCTX-M-65基因的广泛播散和转移。