植物的病毒抗性受到外界环境的影响,高温可以激活植物体对病毒的防御机制,使植物体的病毒症状缓和或完全消失。该现象很早已被发现并在很多文章中阐述,然而其具体的分子机制仍不是十分明确。本研究利用心叶烟和本生烟两种植物材料,探讨了PVX、PVYN病毒诱导的RNA沉默以及瞬时侵染GFP诱导的转基因RNA沉默受温度影响的基本规律和分子机制,以下是具体研究结果。(1)30℃持续处理PVX和PVYN发病植株(热恢复试验)表明,处理后植株上部新生叶片症状逐步减轻,12天后症状完全消失,ELISA检测病毒含量接近健康水平,下部老叶片虽保持发病症状,但病毒含量也持续下降。这说明高温能增强心叶烟抗病毒RNA沉默。植株上部叶片是否表现症状取决于病毒复制扩散与病毒RNA同源降解之间的平衡,22℃条件下,虽然植物体也会发生病毒诱导的RNA沉默,但不足以阻止病毒由发病叶片向新生叶片的扩散,最终导致整株发病;而高温条件下,发病区病毒含量下降,同时由于上部叶片RNA沉默增强,迅速将自下而上扩散的病毒降解,使上部叶片维持无症状态。当症状恢复植株置于22℃条件时,上部叶片会重新发病,这说明RNA沉默与病毒扩散始终处于动态抗衡中。这一研究结果提示,如果RNA沉默达到足够的强度,寄主就能高抗病毒甚至完全不发病。(2)心叶烟病毒热恢复试验表明,参与抗病毒RNA沉默的RDR1、RDR6以不同的方式响应了这一过程。Northern blot结果显示,响应胁迫并具有水杨酸诱导特点的RDR1,其mRNA在30℃高温下逐渐积累,12天时达到最高丰度,此时上部叶片已无症状,而且上部叶片RDR1表达水平明显高于下部叶片,因此推测RDR1很可能参与了高温激活的病毒防御。与健康植株相比,PVX和PVYN发病植株中RDR1 mRNA的积累并未受到病毒显著影响,这说明RDR1很可能直接响应高温而并非受病毒诱导。另一种参与病毒介导RNA沉默的RNA依赖的RNA聚合酶RDR6,在健康植株中的表达量远低于RDR1,而且其表达量在健康植株和感病植株中均表现为不受温度影响。RDR6 mRNA的积累量与PVX病毒积累量成明显正相关,植株下部发病叶片及有症状的上部叶片均维持较高水平的RDR6 mRNA,当上部叶片症状恢复,PVX含量下降至健康水平时,RDR6的表达随之下降到本底水平,因此推测在侵染PVX的植株中,RDR6通过响应寄主细胞中的病毒含量参与寄主的抗病毒RNA沉默。而PVYN感病植株的RDR6却不受病毒的影响,基本维持与健康植株相似的本底水平的表达,因此参与PVYN介导的抗病毒RNA沉默途径的RNA依赖的RNA聚合酶以RDR1为主,RDR6起辅助作用或不起作用。这说明不同病毒诱导的抗病毒RNA沉默可能涉及不同的RNA依赖的RNA聚合酶。(3)心叶烟热恢复试验中,症状一直维持的下部叶片在高温处理过程中均能检测到病毒来源的siRNA,积累量随处理时间增加并没有明显变化,而上部叶片siRNA随着处理时间延长,症状减轻,病毒含量下降,病毒来源的siRNA减少到检测不到的水平(PVX, PVYN侵染植株分别在处理6天和9天时)。这与在本生烟或心叶烟的瞬时侵染试验由转基因介导的RNA沉默中随着沉默增强siRNA积累水平增加的规律不一致,因此病毒siRNA的积累水平可能对应于被降解的病毒RNA量,也就是说siRNA在病毒侵染植株中的积累量不能准确反映植物的抗病毒RNA沉默活性。(4)具有广谱抗性的病程相关蛋白对高温恢复处理也有一定响应。心叶烟健康植株高温持续处理后,下部叶片PR1逐渐积累,而上部新生叶片PR1一直表达微弱,似乎不受温度影响。而发病株PR1的表达明显高于健康植株,经高温处理后上部叶片PR1的表达随症状减轻而下降,下部叶片PR1表达量也略有降低。这说明PR1蛋白对病毒侵染和高温均产生响应,因此很可能也参与了高温激活的病毒防御反应。PVYN病毒恢复试验中,PR1 mRNA的积累增加趋势明显早于健康植株,这很可能是病毒侵染和高温双重因素诱导的叠加效应。但病程相关蛋白是通过介入RNA沉默途径起作用还是直接参与抗病毒反应尚需进一步探讨。(5)心叶烟30℃高温预处理后接种PVX病毒,并置于22℃继续生长观察发病情况。结果表明,高温预处理1-4天的心叶烟,接毒7天后上部叶片表现明显症状,而随着预处理时间的延长,接毒7天后的症状逐渐减轻,预处理12天的心叶烟在接毒7天后已观察不到任何症状,ELISA检测病毒含量接近健康水平。这说明在病毒不存在的情况下,高温依旧能增强抗病毒RNA沉默,而且RNA沉默受高温的诱导有积累效应,需要高温处理一定时间才能达到完全抵抗PVX病毒侵染的作用。将30℃高温预处理12天的心叶烟置于22℃孵育1-4天后接接种病毒,7天后上部叶片仍无明显症状,而随着孵育天数的延长,接毒7天后的症状逐渐加重,22℃孵育12天的心叶烟在接毒7天后已观察到明显症状,ELISA检测病毒含量接近22℃发病株水平。这说明心叶烟中受高温影响而积累的抗病毒RNA沉默随着温度降低后仍能持续一段时间。(6)本生烟对PVX病毒的抗性在高温下也有所增强(30℃),然而30℃高温预处理12天后,接毒7天后植株仍出现明显PVX症状,这不同于心叶烟的试验结果,说明高温虽然能够增强本生烟的抗病毒RNA沉默,但这种增强不能持续,一旦高温条件撤除,抗病毒RNA沉默随之会降低到不足以抵抗病毒入侵的程度。这可能是由于本生烟与心叶烟相比缺乏RDR1(本生烟只有RDR6),而使其RNA沉默途径有所不同。(7)心叶烟和本生烟瞬时侵染GFP试验表明,22℃瞬时侵染5dpi时侵染区发生GFP沉默,而30℃3dpi时侵染区已发生GFP沉默,这说明高温也促进瞬时侵染GFP诱发的转基因RNA沉默。沉默抑制子P19能够延迟沉默发生,但不影响高温增强沉默的趋势。30℃高温预处理12天后,再置于22℃下进行瞬时侵染,发生GFP沉默时间与未经高温预处理的植株类似,这一现象与本生烟中PVX介导的抗病毒RNA沉默对温度的响应类似,而与心叶烟中PVX介导的RNA沉默对温度的响应不同。推测在本生烟中转基因介导RNA沉默与病毒介导的RNA沉默可能存在共同的途径,而心叶烟中两种RNA沉默有不同的机制。