酯酶（EC 3.1.1.x,Esterases）主要包括羧酸酯酶（EC 3.1.1.1,Carboxylesterases）和脂肪酶（EC 3.1.1.3,Lipases）,普遍存在于微生物和动植物中,参与酯水解、酯化、转酯等多种反应。酯酶催化活性高、副反应少,具有广泛的底物特异性、对映异构体选择性等特点,在食品、医药、洗涤剂、造纸等领域均有应用。传统的微生物酯酶基因的筛选方法依赖于微生物的培养与纯化,但自然界中只有0.1%-1%的微生物可以在实验室条件下生长,高达99%以上的微生物难以培养,其蕴含的丰富酯酶资源,大多尚未开发利用。宏基因组技术绕过了微生物的分离培养过程,直接从环境样品中提取总DNA,构建宏基因组文库,通过基于序列或功能的筛选方法从文库中获取酯酶基因,扩大了功能基因的来源,为获取新型酯酶提供了新途径。本研究利用宏基因组技术构建土壤宏基因组文库,采用基于功能的筛选方法,获得新型酯酶基因estXT1,在大肠杆菌BL21（DE3）中实现了estXT1的异源表达,对纯化得到的酯酶EstXT1进行酶学性质表征,将酶与配体小分子进行分子对接和分子动力学模拟计算。主要结果如下:1、土壤宏基因组文库的构建及酯酶基因的筛选。以土壤微生物为研究对象,提取土壤环境DNA,采用噬菌体包装侵染的方法,构建以大肠杆菌为宿主的Fosmid宏基因组文库。通过功能筛选的方法从文库中筛选到一个新型酯酶基因estXT1,其核苷酸序列长1143 bp,编码380个氨基酸残基,预测蛋白分子量为40.0 kDa,等电点为4.60。多序列比对结果显示EstXT1具有第Ⅷ族酯酶的多个特征基序,系统发育分析显示EstXT1与第Ⅷ族酯酶聚为一支,故推定Ser56、Lys59和Tyr165为EstXT1的催化三联体。2、酯酶的异源表达。以筛选到的阳性亚克隆为模板,设计特异性引物扩增estXT1基因,通过酶切酶连的方法克隆到pET-28a（+）表达载体上,构建pET-estXT1重组质粒,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行低温诱导表达,使用镍柱亲和层析法纯化重组酶,经SDS-PAGE验证蛋白条带单一,分子量与预测值相一致。3、酶学性质表征。EstXT1对阿魏酸酯具有水解活性,其催化反应的最适pH为8.0,最适温度为55℃,在pH=7-10.6范围内孵育3 h后可以保持80%以上的活性,具有较强的耐碱性。Zn2+和Co2+对EstXT1有一定的激活作用,Cu2+和CTAB对EstXT1的活性具有强烈抑制作用,常用有机试剂中除了 DMF和DMSO外,对酶活也有明显的抑制作用,此外,EstXT1对去离子型表面活性剂Triton X-100和Tween 80有一定的耐受作用。4、EstXT1与配体的分子对接。以蛋白4IVK为模板,构建EstXT1的三维模型,采用AutoDock Vina软件,将EstXT1和底物MFA进行柔性对接,获得蛋白-底物复合物,蛋白与底物之间存在多个氢键和疏水作用,为配体的稳定结合提供支撑。5、EstXT1的分子动力学模拟计算研究。利用Amber和NAMD软件对蛋白配体复合物进行溶剂化处理,对整个系统进行能量最小化和平衡,最后进行动力学模拟,并对NAMD分子动力学模拟的最后一个平衡构型进行QM/MM模拟,将催化三联体、底物分子和两分子水划为QM区,其余部分作为MM区,分别进行量子力学与分子力学计算。用Amber进行的MM-MD计算得到的总能量较低,为-91385.2304kcal/mol,而用 NAMD 进行的 MM-MD 为-511381.1862 kcal/mol,QM/MM 为-453299.7295 kcal/mol。通过MM-GBSA和MM-PBSA方法计算得到EstXT1和底物MFA的结合自由能分别为-32.1722 kcal/mol和-4.1049 kcal/mol,表明酶与底物之间结合较紧密,催化活性较高。将活性口袋附近的苯丙氨酸Phe128突变为丙氨酸形成突变体F128A,通过丙氨酸扫描分析得到突变体结合自由能增大,丙氨酸的替代不利于配体分子的结合,而活性口袋附近的Phe128对MFA的紧密结合是有利的。本研究中的EstXT1是第Ⅷ家族酯酶,其具有较强的耐碱性,对去离子型表面活性剂Triton X-100和Tween 80有一定的耐受作用,并且可以水解阿魏酸酯类化合物,这些特性使其具有潜在的工业应用价值。该研究结果表明,利用宏基因组技术,能够从不可培养微生物的基因资源中获得新型酯酶,为寻找具有特殊酶学性质的新型酯酶提供了新的研究策略,扩大了功能基因的资源,为工业提供具有潜在应用价值的生物催化剂。此外,对EstXT1与MFA的分子模拟计算结果为酶与配体的结合和催化过程的理解提供了重要依据。