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背景现目前,物理破环及病理切除情况下造成的骨缺损病例,亟需大量植骨材料。由于自体骨骨量的限制及同种异体骨潜在的致病性及免疫原性,大段骨缺损修复形势严峻。传统的组织工程策略虽取得一定疗效,但干细胞的额外扩增步骤,可能带来的感染风险、伦理问题、应用即时性及高额花费限制其应用。近年来,可随取随用、无免疫排斥反应的自体骨髓受到临床工作者的关注,其可应用于突发性骨缺损修复,避免体外扩增的繁琐过程与风险问题,但应用骨髓直接回植,干细胞容易流失,造成疗效不稳定。因此,选择性细胞滞留技术应运而生。其核心是利用支架材料适宜的网孔结构及表面粘附功能实现对骨髓中成骨相关细胞及因子的快速富集。现目前的临床应用中,一般通过同种异体骨作为支架材料,结合选择性细胞富集技术制备自体人工骨,其取得了较好的临床疗效,但异体骨来源受限,且传统支架一般通过物理拦截作用拦截细胞,富集方式较为单一,缺乏有效的成骨作用。因此,仍需继续优化选择性细胞滞留技术的支架构建策略及富集效率。综上,我们设想将可自组装形成类细胞外基质材料RADA16-Ι序列与具有成骨活性的甲状旁腺素功能短肽TRSAW序列相结合,构建自组装多肽RADA16/TRSAW,修饰HA/β-TCP双向生物陶瓷支架,以物理拦截及电荷吸引细胞及因子的黏附方式,有效提高选择性细胞滞留技术的富集效率。目的1.构建具有成骨诱导活性多肽,分析多肽的物理性能及生物性能,初步评价作为修饰材料的合理性。2.构建多肽修饰HA/β-TCP功能支架材料,通过MSCs悬液体外模拟干细胞滞留技术,评价支架生物性能,为多肽修饰HA/β-TCP支架应用于SCR技术奠定基础。3.将多肽功能支架植入裸鼠体内,评价其成骨活性,为临床转化提供参考。方法1.通过原子力显微镜分析多肽微观结构,圆二色谱验证二级结构,ZATA电位仪测试材料所带电荷量,接触角验证材料亲水性能等物理性能,筛选出合适的凝胶构建策略进行体外细胞实验。2.将MSCs接种于多肽凝胶构建形成的微环境,通过形态学观察、荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹等生化实验评价凝胶多肽对于MSCs的生长、粘附、成骨分化、促血管生成等行为的影响。3.凝胶修饰HA/β-TCP形成复合材料,通过环境扫描电镜(ESEM)观察修饰后材料形貌,荧光强度反应富集处理前后凝胶肽的稳定性。将MSCs通过SCR技术接种于多肽与支架构建的功能材料上,以形态学观察、荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白印迹等生化实验评价凝胶多肽对于MSCs的生长、成骨分化等行为的影响。体外利用流式细胞术,细胞特异标记蛋白染色,分析SCR技术下,功能支架TRSAWmax功能支架对于骨髓中各类细胞的富集效率,而后将其植入裸鼠体内,分析其成骨活性,对其应用做进一步探讨。结果1.在PBS溶液触发下,RADA16-Ι、TRSAWmax可形成凝胶形态,而RADA16/TRSAW则为半凝胶状态,综合比较三种多肽成纤维网状结构、二级结构、稳定性及亲水性等性能,RADA16-Ι、TRSAWmax组均具有较稳定的β二级结构、纤维立体网状结构,亲水性能佳等特点,RADA16/TRSAW多肽物理性能均弱于前两组多肽。因此,在后续生物学评价中排除RADA16/TRSAW组。2.CCK-8试剂检测细胞在不同材料,各项时间点的增殖情况,RADA16-Ι、TRSAWmax组优于平板培养组,成骨诱导培养基进行诱导3、7、14天后以qPCR、WesternBlot和碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行检测,成骨诱导3天,TRSAWmax功能支架材料组Ang1表达相较于单纯材料组与RADA16-Ι组具有统计学差异(),将各组MSCs培养3天上清液取出共培养EPC,结果显示TRSAWmax组血管网状生成现象明显;成骨诱导7、14天,TRSAWmax功能支架材料组,在不同时间点,均能稳定表达具有各时期代表性的成骨相关蛋白。3.在PBS溶液触发下,通过环境扫描电镜观察RADA16-Ι、TRSAWmax水凝胶可均匀附着于HA/β-TCP材料表面,荧光强度比较了富集操作前后,多肽的释放规律。以MSCs细胞悬液模拟选择性细胞滞留技术后,CCK-8证实了TRSAWmax功能支架材料滞留了更多MSCs,增殖细胞数在5、7、9天具有统计学差异(),成骨诱导培养基进行诱导7、14后,以qPCR、WesternBlot和碱性磷酸酶活性检测试剂盒进行检测,7、14天TRSAWmax功能支架材料组具有更高的Runx2、ALP、OPN和OCN的基因表达水平和蛋白表达水平,相关成骨通路可通过Src调节Erk促进成骨。4.通过流式细胞术检测,TRSAWmax对骨髓中有核细胞、单核细胞、CD90+/CD105+双阳性类MSCs细胞以及CD34+CD31+类内皮组细胞的富集效率,显著高于单纯材料组,具有统计学差异,通过micro-CT及HE、Masson染色,进一步验证了TRSAWmax修饰支架具有较好的骨修复作用。结论1.在RADA16-Ι的基础上添加功能性短肽,一方面,通过合理的配比对自组装过程并不造成影响,另一方面,增加了水凝胶的生物学性能,所构成的微环境,对于MSCs黏附、成骨分化、成血管具有促进作用,为理想的修饰材料。2.通过离子溶液触发,多肽水凝胶可均匀修饰于HA/β-TCP材料表面,增加材料的亲水性和粘附性,所构建的微环境适于MSCs的贴壁铺展,成骨分化及钙质沉淀。3.自组装多肽TRSAWmax,修饰HA/β-TCP陶瓷支架,应用于SCR技术中,以孔径物理拦截及电荷吸附的方式富集细胞,提高选择性细胞滞留技术的效率;同时,通过添加的TRSAW基团提高材料的成骨诱导能力。为优化干细胞富集技术提供参考。