背景:肝细胞癌(HCC)是世界范围内最为普遍的恶性肿瘤之一,每年因肝癌导致的死亡人数约70万人。整个东亚地区因乙型病毒性(HBV)肝炎及丙型病毒性(HCV)肝炎的高患病率成为肝癌的高发地区,而我国的肝癌发病例数及死亡例数约占全球总数的50%以上。现在针对肝癌的检查手段有CT、肝脏肿瘤特异性磁共振(普美显)及超声造影等,治疗方法包括开腹或腹腔镜下肝部分切除、局部射频消融、介入栓塞、同种异体肝移植、靶向治疗及免疫治疗等,虽然检查及治疗的方法较从前均有明显的进步,但仍因部分患者早期症状隐匿或术后复发等因素造成肝癌患者的总体预后不理想。泛素化是一种蛋白质的翻译后修饰,通过酶促反应将泛素分子(ubiquitin)连接到底物蛋白上。被泛素分子标记的底物蛋白其后在蛋白酶体发生结构性降解。泛素化广泛参与到包括细胞周期、分裂、死亡等多种生理过程,而异常的泛素化水平可能促进肿瘤的发生、发展。E3泛素连接酶在泛素化中的功能是识别底物并促进底物与泛素分子之间的共价结合,其中最大的蛋白家族——Skp1/Cul1/F-box蛋白(SCF)E3连接酶是一种多亚基的RING型E3连接酶。在SCF E3连接酶中,F-box蛋白是具体执行底物识别的功能单元,不同的F-box蛋白因识别特异性底物而具有各异的功能。β-Tr CP是一种含有WD40模体的F-box蛋白,又称FBXW1,通过识别、促进不同底物的泛素化以调节诸如细胞周期、凋亡等生理过程。已有研究表明β-Tr CP在多种肿瘤中具有致癌功能,然而肝癌中相应的作用机制仍不明确,有待进一步阐明。NF-κB抑制因子α(IκBα)是IκB蛋白家族的成员,该蛋白家族的特征是C端有锚蛋白的重复序列。正常情况下,IκBα在细胞胞浆中与NF-κB二聚体结合从而阻止NF-κB穿梭入细胞核,使其停留在细胞胞质内。诸如脂多糖、肿瘤坏死因子(TNF)及生长因子等多种细胞外信号可以激活IκB激酶(IKK)复合物导致IκBα发生降解,NF-κB转变为游离状态转移进细胞核。因此,肿瘤中IκBα表达降低可能是肿瘤细胞中NF-κB活性异常升高的重要原因。虽然目前已有研究报道了IκBα对NF-κB的抑制作用,但其在肝癌中的表达状态、功能及相关分子机制仍有待进一步完善。Erbin是亮氨酸富集重复和PSD-95/Dlg/ZO-1(PDZ)结构域蛋白家族成员,可与Erb-b2受体酪氨酸激酶2(ERBB2)蛋白结合并调节其功能与分布。除了与ERBB2结合,Erbin还具有其他功能:通过抑制Akt活性或抑制Ras/Raf信号通路激活发挥抑癌作用,或通过激活雌激素受体(ER)、抑制STAT3信号通路发挥致癌作用。因其具有截然相反的功能,对于Erbin在肿瘤中所发挥的作用仍存在一定争议。已有研究报道TNFα及脂多糖等因子可升高Erbin的表达,HCC中也观察到的Erbin表达升高,但导致表达水平升高的上游分子机制还不明确。基于上述背景,本研究拟通过在HCC组织和HCC细胞水平进行实验,初步探究β-Tr CP、IκBα和Erbin在HCC与癌旁组织中表达量水平、在HCC细胞中发挥何种功能以及蛋白质之间可能存在的关联或机制。方法:1、利用免疫组织化学对西南医院肝胆外科标本库中2011年至2013年取得的HCC标本进行染色,对β-Tr CP、IκBα和Erbin蛋白表达量进行评估,并结合临床资料评价蛋白表达水平与患者生存时间等临床指标是否存在关联;2、选择Huh7及HCCLM3细胞进行细胞水平实验。分别利用过表达质粒及小干扰RNA实现蛋白质的过表达或敲低,并利用荧光实时定量PCR或Western blot等方法进行验证转染效果,构建相应细胞模型;3、利用免疫共沉淀、体内泛素化实验检测蛋白间相互作用;利用CCK-8、克隆形成、Transwell迁移实验及相应Rescue实验等方法探究β-Tr CP、IκBα和Erbin在HCC细胞中的功能。结果:1、免疫组织化学染色表明,相较对应癌旁组织,β-Tr CP在HCC组织中表达水平升高,Kaplan-Meier生存分析提示β-Tr CP高表达的HCC患者生存时间明显缩短(p=0.0253)。CCK-8实验及克隆形成实验结果表明,过表达β-Tr CP后HCC细胞增殖水平升高,干扰β-Tr CP后HCC细胞增殖减弱;Transwell迁移、侵袭实验及real-time PCR检测侵袭标志物实验结果表明,过表达β-Tr CP后HCC细胞迁移、侵袭能力增强,干扰β-Tr CP后HCC细胞迁移、侵袭能力减弱。2、Western blot实验检测β-Tr CP常见底物蛋白表达提示,干预β-Tr CP表达后,IκBα表达水平变化明显。进一步应用免疫共沉淀实验探究蛋白间相互作用,发现β-Tr CP可以与IκBα发生蛋白间相互结合;体内泛素化实验表明,β-Tr CP在细胞中可介导IκBα泛素化;经抑制蛋白酶体活性的MG132处理后,细胞中因过表达β-Tr CP而降低的IκBα的蛋白表达水平回升。在HCC细胞中过表达β-Tr CP的同时过表达IκBα或干扰NF-κB p65,CCK-8实验及Transwell迁移实验表明可有效逆转因β-Tr CP过表达增强的细胞增殖或迁移能力。免疫组化染色表明,IκBα在HCC组织中表达水平相较癌旁组织下降,Kaplan-Meier生存分析提示IκBα低表达的HCC患者生存时间明显缩短(p=0.0009)3、Western blot及real-time PCR实验结果表明NF-κB可在m RNA及蛋白质水平促进Erbin表达,在HCC细胞中过表达Erbin后,CCK-8及Transwell迁移实验显示HCC细胞增殖及迁移能力增强,敲低Erbin后细胞增殖及迁移能力减弱;Erbin干扰后可有效减弱因NF-κB过表达而增强的HCC细胞增殖及迁移能力。4、与对应癌旁组织相比,HCC组织中Erbin表达升高。Kaplan-Meier生存分析提示高表达Erbin的HCC患者生存时间明显缩短(p=0.0253);通过临床相关性分析发现Erbin表达水平与肿瘤TNM分期(p=0.039)及复发(p=0.010)相关。在HCC组织层面,β-Tr CP与IκBα表达水平呈负相关(p<0.001),与Erbin的表达水平呈正相关(p<0.001);结论:β-Tr CP在HCC组织中高表达,且与HCC患者生存时间呈负相关。高表达的β-Tr CP通过抑制IκBα、上调NF-κB p65活性进而诱导Erbin高表达(β-Tr CP/IκBα/NF-κB/Erbin信号通路)促进HCC细胞增殖及迁移能力。