肝纤维化是肝组织的损伤修复反应过程,是以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质在肝组织的的净沉积。肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理变化特征,是各种慢性肝病进展为肝硬化的必经病理阶段。而肝硬化治疗困难、死亡率高。因此,调控肝纤维化对改善慢性肝病预后至关重要,并且已成为研究的热点。在肝损伤时,活化的肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是造成细胞外基质沉积的主要细胞。在正常肝脏中,HSC处于静止状态,存在于Disse间隙。静止状态的HSC富含大量脂滴,其主要由脂肪酸、甘油三酯和维生素A等组成。在肝损伤发生时,HSC在旁分泌信号的作用下发生活化,细胞内脂滴丢失,转化为肌成纤维细胞表型;获得收缩、迁移、促纤维化等新特性;并开始表达α-平滑肌肌动蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA),分泌以Ⅰ型胶原为主的细胞外基质并造成细胞外基质的净沉积。活化的HSC是肝纤维化发生及进展的关键细胞。因此,如何抑制HSC的活化成为治疗肝纤维化研究的重要方向。自噬(通常所说的自噬泛指巨自噬,本文中的自噬亦均指巨自噬)是真核细胞在进化过程中的一种高度保守的代谢机制。自噬发生时,细胞通过双层膜包裹细胞质中的细胞器、脂滴等成分形成自噬体,随后在自噬体与溶酶体融合之后包裹的内容物被溶酶体降解,营养成分和所产生的能量则重新被细胞利用。自噬作为一种分解代谢过程对维持细胞内稳态至关重要。HSC的活化和细胞外基质的合成、分泌均是耗能过程,需要持续的的能量供应。研究证实,HSC活化时自噬将细胞内的脂滴吞噬、分解并释放脂肪酸,后者经β氧化作用生成ATP;此过程是HSC活化主要的能量来源;阻断自噬可抑制HSC的活化。但常用的自噬抑制剂因长期体内应用时常导致严重的不良反应,而在治疗肝纤维化的应用中受到限制。因此,如何有效且安全地抑制HSC自噬成为抑制HSC活化研究的重要课题。αα-酮戊二酸是细胞内的一种天然成分,主要参与营养物质的的代谢过程,对其调控的安全性较高。近年多项研究证实改变细胞内的α-酮戊二酸水平可调控细胞的自噬,但可能因为这些研究涉及的细胞类型各异,目前尚无一致的研究的结论。并且在本实验之前,尚无通过改变α-酮戊二酸水平调控HSC自噬或活化的研究。α-酮戊二酸二甲酯(dimethyl α-ketoglutarate,DMKG)是α-酮戊二酸水平调控研究的常用试剂。相对于α-酮戊二酸本身,DMKG更易通过细胞膜。DMKG进入细胞后将迅速被细胞内的酯酶分解并生成α-酮戊二酸,从而显著提高细胞内α-酮戊二酸水平。本实验研究了 DMKG对HSC活化及肝纤维化的影响,并验证该影响是否与自噬有关联,另外我们也对DMKG影响HSC自噬的可能机制进行了探索。第一部分:体外实验中DMKG对HSC的活化的影响目的:体外实验中,利用MTT法检测梯度浓度的DMKG对肝细胞系、活化的HSC细胞系生存率的影响,筛选出不影响两种细胞系生存率的DMKG安全浓度范围。活化表型的HSC细胞系在添加上述安全浓度的DMKG培养后,利用实时定量RT-PCR法及western-blot法检测HSC活化指标的表达变化,评估DMKG对HSC活化的影响。方法:1.采用肝星状细胞系HSC-T6和肝细胞系BRL-3A进行实验。HSC-T6为永生活化表型。两者均用高糖DMEM+10%胎牛血清常规培养。2.向HSC-T6和BRL-3A细胞系的培养基中加入梯度浓度的DMKG(0-32mM),培养24小时后,利用MTT法检测细胞生存率,并进行定量分析。3.用上述方法探索得到不影响两种细胞生存率的DMKG浓度范围,向HSC-T6细胞系培养基中加入上述浓度范围内的DMKG,并设置空白对照组,培养结束后,利用Trizol提取细胞总RNA,利用实时定量RT-PCR法检测HSC活化指标Ⅰ型胶原、α-SMA的mRNA水平,并进行相对定量分析。4.向HSC-T6细胞系培养基中加入同上一步相同浓度的DMKG,并设置空白对照组,培养结束后,利用RIPA裂解液提取细胞总蛋白,利用western-blot法检测HSC活化指标Ⅰ型胶原、α-SMA的蛋白表达量,并进行相对定量分析。结果:1.DMKG浓度在1-18mM范围内时,对肝细胞生存率无显著影响。DMKG浓度在20-32mM范围内时,对肝细胞生存率产生浓度依赖性抑制作用。2.DMKG浓度在1-16mM范围内时,对HSC的生存率无显著影响。DMKG浓度在18-32mM范围内时,对HSC细胞生存率产生浓度依赖性抑制作用。3.DMKG浓度在18-32mM范围内时,对于同样浓度的DMKG,HSC的生存率显著低于肝细胞的生存率。4.4mM浓度的DMKG能显著下调HSC细胞α-SMA的mRNA水平;1mM及4mM浓度的DMKG均能显著下调HSC细胞Ⅰ型胶原的mRNA水平。5.1mM、4mM浓度的DMKG均可显著抑制HSC细胞α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达。结论:1.低浓度(≤16mM)的DMKG短时间内并不影响肝细胞及HSC的生存率,且肝细胞比HSC对高浓度(≥18mM)DMKG的生存率抑制耐受性更好。2.体外实验中,安全浓度范围内低浓度(1mM、4mM)的DMKG即可显著抑制HSC的活化。第二部分:DMKG对CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型的影响目的:建立CCl4诱导的大鼠肝纤维化模型,在造模期间腹腔注射DMKG,观察DMKG对肝纤维化程度及肝功能的影响。方法:1.动物模型:6周龄成年雄性Wistar大鼠,将50%CCl4橄榄油溶液1ml/kg(即CCl4,0.5ml/kg)每周两次(周二、周四)大鼠腹腔注射,共9周。2.药物干预及分组:20只大鼠随机分为正常对照组、单纯DMKG腹腔注射组、CCl4模型组、CCl4模型+DMKG腹腔注射干预组。每组5只。模型组造模方法如上所述。CCl4模型+DMKG腹腔注射干预组在造模之日起,每周2次(周三、周五)DMKG 200mg/kg(溶于2ml PBS)腹腔注射。单纯DMKG注射组在给与以上剂量DMKG注射的同时,给与单纯橄榄油0.5ml/kg腹腔注射。正常对照组,只给与相同剂量的橄榄油和PBS腹腔注射。满9周时,所有大鼠全部处死并留取肝组织及血清标本。3.肝脏组织化学染色:新鲜大鼠肝组织福尔马林溶液固定、石蜡包埋、并制成5μm厚石蜡切片。利用Masson复合染液、亮绿染液对石蜡切片进行Masson染色,显微镜下可见胶原纤维被染成绿色。利用苦味酸天狼星红染液染液对石蜡切片进行天狼星红染色,染色后的组织切片在偏振光显微镜暗场下可见Ⅰ型胶原纤维紧密排列,显示很强的双折光性,为亮红-亮橘红色纤维。天狼星红染色阳性面积计算公式:天狼星红阳性面积/(照片面积—照片中管腔面积)×100%。4.肝组织羟脯氨酸含量检测:利用比色法测定肝组织羟脯氨酸的含量,可以反映肝纤维化程度。肝组织研磨制成匀浆,用浓盐酸进行酸水解。水解后的样品用氢氧化钠中和后,加入ehrlich试剂显色,测量570nm波长吸光度值。根据羟脯氨酸标准品绘制标准曲线,并以此计算各样本的羟脯氨酸含量。5.肝功能检测:ALT、AST可反映肝细胞的损伤程度。利用相应成品试剂盒进行检测,操作依据试剂盒说明书进行。结果:1.Masson染色和天狼猩红染色均显示CCl4模型+DMKG腹腔注射干预组的胶原纤维面积较CCl4模型组明显减少。定量分析显示,天狼猩红染色阳性面积减少了 44%。2.CCl4模型+DMKG腹腔注射干预组的肝组织羟脯氨酸含量较CCl4模型组显著降低。3.ALT与AST化验结果显示,正常对照组与单纯DMKG腹腔注射组之间无显著差别、CCl4模型组与CCl4模型+DMKG腹腔注射干预组之间无显著差别。结论:1.体内实验中,DMKG可减轻CCl4肝纤维化模型的肝纤维化程度。2.体内应用时,DMKG并不诱发或加重肝细胞损伤。第三部分:DMKG影响HSC活化及肝纤维化的机制研究目的:本部分实验将探讨DMKG影响HSC活化的机制是否自噬有关。若有关联,本部分还将对DMKG影响HSC自噬的可能机制进行探索。方法:1.肝组织免疫荧光染色(双标):α-SMA是HSC活化的标记物,而在肝细胞并无表达。LC3B和Beclin-1均为反映自噬强度的指标,与自噬呈正相关。5μm厚的石蜡切片经脱蜡处理后,煮沸行抗原修复。切片经相应的一抗(小鼠源抗α-SMA、兔源抗LC3B或Beclin-1)孵育过夜后,再用对应的二抗(α-SMA对应红色荧光二抗、LC3B和Beclin-1对应绿色荧光二抗)孵育。荧光显微镜下观察并拍照。利用软件对红绿荧光强度、共定位关系进行分析。2.透射电子显微镜观察自噬体是自噬检测的"金标准"。为明确DMKG对HSC自噬的影响,HSC-T6培养基内加入DMKG培养后,对细胞进行固定并超薄切片,透射电子显微镜观察自噬体并进行定量分析。3.3MA是经典的自噬抑制剂。HSC-T6培养基内分别加入DMKG、3MA培养后,提取细胞总蛋白。Western-blot检测HSC活化指标α-SMA、Ⅰ型胶原以及自噬指标LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表达。通过对比DMKG与3MA对HSC自噬及活化的影响,明确自噬在DMKG影响HSC活化中的作用。4.HSC-T6培养基内加入DMKG培养后,对细胞行油红染色以显示细胞内的脂滴。对脂滴占细胞的面积进行定量分析。5.HSC-T6培养基内加入DMKG培养后,利用ATP测定试剂盒对HSC细胞内ATP水平进行测定,操作按照试剂盒说明书进行。6.激活mTORC1可抑制自噬。S6核糖体蛋白作为mTORC1的下游底物,其磷酸化水平可较准确地反映mTORC1的活性。向HSC-T6培养基加入DMKG培养后,western-blot检测细胞S6蛋白总含量、磷酸化S6蛋白的含量。计算S6蛋白的磷酸化水平,以评估DMKG对HSC细胞mTORC1活性的影响。7.DMKG可增高细胞内α-酮戊二酸的含量,而α-酮戊二酸可通过代谢途径转换为乙酰辅酶A。有文献提示乙酰辅酶A可能增强组蛋白乙酰化酶EP300的活性,而另外的文献则提示EP300可通过使部分自噬相关蛋白发生乙酰化而抑制自噬。硫辛酸是DMKG之外的另外一种可提高细胞内乙酰辅酶A水平的物质,而c646是乙酰辅酶A对EP300作用的特异性阻断剂。我们通过向HSC-T6细胞的培养基中添加DMKG、硫辛酸以及c646培养后,western-blot检测自噬指标LC3B、Beclin-1以及HSC活化指标α-SMA和Ⅰ型胶原的蛋白表达水平。以明确DMKG抑制HSC自噬的机制,并进一步验证DMKG通过抑制HSC自噬而抑制HSC活化的结论。结果:1.肝组织免疫荧光(双标)染色显示,自噬指标的荧光强度和HSC活化指标的荧光强度在肝纤维化模型组均显著增高,经DMKG干预后两者均显著下降。并且自噬指标和HSC活化指标存在显著的共定位关系。说明肝组织中HSC的活化与HSC自噬水平存在相关性,且均可被DMKG抑制。2.透射电镜观察结果显示,对照组HSC细胞内可见大量双层膜结构的自噬体。DMKG处理后,HSC细胞内自噬体的数量显著下降,即DMKG可抑制HSC的自噬。3.HSC细胞DMKG处理组和3MA处理组,自噬指标均出现显著下降。更重要的是,HSC活化指标的下降趋势与自噬指标的下降趋势一致。说明DMKG通过抑制自噬而抑制HSC的活化。4.之前有研究证实自噬促进HSC细胞内脂滴的丢失并将其分解生成ATP,以促进HSC的活化。本实验油红染色及ATP测定证实,DMKG可阻断HSC脂滴的丢失并能下调细胞内ATP水平。5.DMKG对S6核糖体蛋白的磷酸化水平无显著影响,即DMKG并不影响HSC的mTORC1活性。该结果说明DMKG抑制HSC自噬的机制为非mTORC1依赖的途径。6.DMKG和硫辛酸均是乙酰辅酶A的供体,结果显示HSC的自噬既能被DMKG抑制也能被硫辛酸抑制;c646是乙酰辅酶A与EP300作用的特异性抑制剂,结果显示c646能逆转DMKG和硫辛酸对HSC自噬的抑制作用。该结果说明DMKG通过乙酰辅酶A-EP300途径抑制了 HSC的自噬。另外,c646逆转DMKG、硫辛酸对HSC自噬抑制作用的同时,两者对HSC活化的抑制也被逆转,这进一步说明DMKG通过抑制HSC自噬进而抑制其活化。结论:1.DMKG通过抑制HSC的自噬抑制了 HSC的活化和肝纤维化。2.DMKG通过乙酰辅酶A-EP300途径抑制了 HSC的自噬。