论文部分内容阅读
目的:观察大鼠脊髓星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧复糖(oxygen-glucose deprivation/restoration,OGD/R)损伤后,高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)的表达以及细胞凋亡情况,并研究HMGB1对大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R损伤后细胞凋亡的调节作用及其机制。方法:实验将分为三部分进行:第一部分,观察大鼠脊髓星形胶质细胞经过氧糖剥夺后,不同复氧时间处理后细胞凋亡情况,以及HMGB1的表达及释放情况。提取培养新生1-2日Sprague Dawley(SD)大鼠脊髓星形胶质细胞,建立氧糖剥夺/复氧复糖(OGD/R)模型,模拟脊髓损伤后大鼠脊髓缺血/再灌注损伤的病理过程。实验分为4组:正常组(未行氧糖剥夺/复氧复糖处理的细胞),OGD6h/R6h组(氧糖剥夺6h,复氧复糖6h处理的细胞),OGD6h/R12h组,OGD6h/R24h组。应用MTT法检测各组细胞活性,免疫酶联吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测各组细胞培养基内HMGB1释放量,Western Blot法检测各组细胞内HMGB1、Bcl2、Bax蛋白的表达量。第二部分,研究抑制HMGB1后对OGD/R处理的大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡的影响。根据第一部分实验中的结果,选出研究HMGB1调节脊髓星形胶质细胞凋亡的典型时间点。应用慢病毒干扰沉默大鼠脊髓星形胶质细胞的HMGB1基因,及使用丙酮酸乙酯(Ethyl pyruvate,EP)作为HMGB1抑制剂。实验分为五组:正常组,OGD/R组,OGD/R+HMGB1 shRNA组,OGD/R+阴性shRNA组,OGD/R+EP组。应用MTT法检测各组细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,免疫酶联吸附试验(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)检测各组细胞培养基内HMGB1释放量,Western Blot法检测各组细胞内HMGB1、Bcl2、Bax蛋白的表达量。第三部分,探究HMGB1能否通过活化Toll样受体4(TLR4)/c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路来调节OGD/R后脊髓星形胶质细胞凋亡。应用TLR4抑制剂(CLI-095,浓度为5μM/L)抑制TLR4表达及JNK抑制剂(SP600125,浓度为10μM/L)抑制JNK表达。实验分为七组,正常组,OGD/R组,OGD/R+HMGB1 shRNA组,OGD/R+阴性shRNA组,OGD/R+EP组,OGD/R+CLI095组,OGD/R+SP600125组。应用Western Blot法检测各组细胞内Bcl2、Bax、TLR4、JNK、P-JNK蛋白的表达量。结果:第一部分:(1)MTT结果显示:与正常组细胞相比,OGD/R各组细胞活性明显降低(P<0.05),并且在复氧复糖24h时细胞活性率最低。(2)ELISA结果显示:与正常组细胞培养基内HMGB1含量相比,OGD/R各组培养基内HMGB1浓度明显增多(P<0.05),并且在复氧复糖24h时HMGB1浓度最高。(3)Western Blot结果显示:与正常组相比较,OGD/R各组细胞内HMGB1的表达明显增多(P<0.05),且在复氧复糖24h时,HMGB1的表达量最多;Bcl2与Bax表达量的比值Bcl2/Bax明显增高(P<0.05),且在复氧复糖24h时,Bcl2/Bax比值达到最高。根据这一部分实验结果,我们选择OGD6h/R24h作为接下来的研究时间点。第二部分:(1)MTT结果显示:与OGD/R组细胞相比,OGD/R+HMGB1 shRNA组与OGD/R+EP组细胞活性明显提升(P<0.05),而OGD/R+阴性shRNA组细胞活性无明显差别(P>0.05)。(2)流式细胞仪检测发现,与OGD/R组细胞相比,OGD/R+HMGB1 shRNA组与OGD/R+EP组细胞凋亡程度明显减轻(P<0.05),而OGD/R+阴性shRNA组细胞凋亡无明显差别(P>0.05)。(3)ELISA结果显示:OGD/R组细胞相比,OGD/R+HMGB1 shRNA组与OGD/R+EP组培养基内HMGB1浓度明显降低(P<0.05),而OGD/R+阴性shRNA组培养基内HMGB1含量并无差别(P>0.05)。(4)Western Blot结果显示:OGD/R组细胞相比,OGD/R+HMGB1 shRNA组与OGD/R+EP组细胞内HMGB1的表达明显减少(P<0.05);Bcl2与Bax表达量的比值Bcl2/Bax明显降低(P<0.05),而OGD/R+阴性shRNA组细胞内蛋白表达量无明显差别(P>0.05)。结果表明抑制HMGB1的表达后,细胞的凋亡程度明显减轻。第三部分:Western Blot结果显示:与OGD/R组细胞相比,OGD/R+CLI095组TLR4表达水平明显减少,p-JNK表达水平明显减少,Bcl2表达明显增加,Bax表达明显减少,其表达比值Bcl2/Bax明显增加,细胞凋亡水平明显降低(P<0.05);与OGD/R组细胞相比,OGD/R+SP600125组TLR4表达水平无明显改变(P>0.05),而p-JNK表达水平明显减少,Bcl2表达明显增加,Bax表达明显减少,其表达比值Bcl2/Bax明显增加,细胞凋亡水平明显降低(P<0.05)。结果表明TLR4/JNK通路参与调节了脊髓星形胶质细胞的凋亡。结论:1、大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R后,细胞活性率降低,释放进入培养基内的HMGB1增多,细胞HMGB1的表达水平增加,细胞的凋亡程度增加。2、抑制HMGB1的表达与释放可以减少OGD/R损伤后大鼠脊髓星形胶质细胞Bcl2/Bax的比值,降低细胞的凋亡程度。3、大鼠脊髓星形胶质细胞OGD/R后,HMGB1可以通过激活TLR4/JNK通路来调节细胞凋亡。