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目的:偏头痛是一种常见的、多因素的神经血管性疾病,人群患病率约为15%,其临床表现为反复发作性的间断性头痛。偏头痛的高发年龄在25-55岁,严重影响患者的生活与工作。偏头痛尽管流行,但是其病理生理机制仍不明确,因而有效的药物治疗仍有待探究。头痛是一种主观感受,故所有关于偏头痛机制的研究必须加以整体水平的验证。现有的偏头痛模型仍有局限,本研究拟采用反复酸性刺激清醒状态下小鼠的硬脑膜,在刺激时间和刺激次数上模拟慢性偏头痛的发病机理,以期获得更优的慢性偏头痛模型。此外,本研究在此慢性偏头痛模型上初步探讨ASICs、P/Q型钙通道(Cav2.1)在偏头痛发生中的可能作用。方法:1.C57BL/6小鼠按随机数字法分成四组:假手术组(Sham组);阴性对照组:给予 PH=7.4SIF 间质液(synthetic interstitial fluid,SIF)处理,简称 PH 7.4 组;实验组给予PH=6.0 SIF,简称PH 6.0组;阳性对照组:给予炎性汤(Inflammatory soup,IS);每组6只。隔日间断硬脑膜给药8次后,观察小鼠头痛行为学;免疫组织化学染色检测小鼠三叉神经脊束核尾侧亚核c-FOS基因及中脑导水管周围灰质降钙素基因相关肽(CGRP)表达,探讨实验组是否可以模拟偏头痛的发作;2.探讨阿米洛利(Amiloride)及AMG-9810对酸诱导的慢性偏头痛的影响。C57BL/6小鼠按随机数字表法分成三组:PH 6.0组,PH 6.0 +Amiloride组,PH 6.0+AMG-9810组,每组6只。隔日间断刺激小鼠的硬脑膜,给药8次后,观察小鼠头痛行为学、检测三叉神经脊束核尾侧亚核c-FOS基因表达。比较阿米洛利及AMG-9810分别对酸诱导的慢性偏头痛模型的影响;3.末次给药2小时后,取方法1中阴性对照组与实验组小鼠的三叉神经节及三叉神经颈复合体,采用荧光定量PCR、Western blotting分别检测其ASICs相关亚型(ASIC1a、ASIC3)、P/Q型钙通道mRNA及蛋白的表达。4.进一步探讨P/Q型钙通道相关的CaMK Ⅱ磷酸化在酸诱导的慢性偏头痛模型中的作用。C57BL/6小鼠按随机数字表法分成三组,PH 7.4组,PH 6.0组,PH 6.0+KN-93组,每组6只,分别用以上三种液体隔日间断刺激小鼠的硬脑膜,给药8次后,观察小鼠头痛行为学、检测小鼠三叉神经脊束核尾侧亚核c-FOS基因的表达;此外,取末次给药2小时后三组小鼠的三叉神经颈复合体,采用Western blotting检测CaMK Ⅱ磷酸化水平。结果:1.末次给药后观察发现,PH 6.0组小鼠较PH 7.4组更容易出现抓挠头面部皮肤、爬笼等烦躁不安的现象,而与炎性汤组相比无明显差异;PH6.0组小鼠2h内挠头持续时间(736±66秒)与PH 7.4组(127±18秒)比较差异有统计学意义(t=21.824,P=0.000),与 IS(747±73 秒)比较无统计学差异(t=-0.277,P=0.787)；PH 6.0小鼠三叉神经脊束核尾侧亚核c-FOSp阳性神经元数量(121 ± 18.7)与PH7.4组(14±2.8)相比差异有统计学意义(t=113.893,P=0.000),与IS组(124±19.8)相比无统计学差异(t=-0.240,P=0.816);PH6.0组小鼠中脑导水管周围灰质表达CGRP神经元数量(42±2.8),与PH7.4组(8±1.4)相比差异有统计学意义(t=26.336,P=0.000),与IS组(40±2.8)相比无统计学差异(t=1.225,P=0.249)。2.行为学观察发现,PH6.0+Amiloride组小鼠较PH6.0组不容易出现烦躁现象,而PH6.0+AMG-9810组小鼠与PH6.0组相比均表现烦躁现象,爬笼次数较未给药前明显增多;统计各组小鼠抓挠头面部皮肤持续时间,PH6.0+Amilori(de组(343±45秒)较PH 6.0组(736±66秒)明显减少,差异有统计学差异(t=12.05,P=0.000);而PH6.0+AMG-9810组(721±79秒)较 PH 6.0组没有统计学差异(t=0.34,P=0.741);免疫组织化学染色PH 6.0 + Amiloride组c-FOS阳性细胞数(42±4.5)较PH 6.0组(121±18.7)明显减少,差异有统计学差异(t=10.072,P=0.000);而PH 6.0+AAMG-9810组(117±17.2)较PH 6.0组没有统计学差异(t=0.448,P=0.663)。3.酸诱导慢性偏头痛组小鼠三叉神经节中的ASICla、ASIC3及P/Q型钙通道mRNA 相对表达量分别是 PH7.4 组的(1.59±0.07)、(1.65±0.08)及(1.6±0.17)倍,差异均有统计学意义(t=-19.74,P=0.000;=-18.878,P=0.000;t=7.761,P=0.0015);酸诱导慢性偏头痛组小鼠三叉神经颈复合体中的ASICla、ASIC3及P/Q型钙通道蛋白表达量分别是阴性对照组的(1.67±0.23)、(1.74±0.24)及(1.30±0.05)倍,差异均有统计学意义(t=-5.01,P=0.007;t=-5.352,P=0.033;t=5.774,P= 0.0287)。4.行为学观察发现,PH 6.0 +KN-93组小鼠较PH 6.0组烦躁现象减少,但较PH 7.4组小鼠爬笼次数增多。统计各组小鼠抓挠头面部皮肤持续时间,PH 6.0 +KN-93组(437±44秒)较PH6.0组(736±66秒)明显减少,差异有统计学意义(t=9.220,P=0.000),而 PH6.0 + KN-93 组较 PH7.4 组(127±18 秒)差异也有统计学意义(t=-15.908,P=0.000);免疫组化染色发现PH6.0 + KN-93组c-FOS阳性细胞数(40±3.4)较PH6.0组(121±18.7)明显减少,差异有统计学差异(t=-10.456,P=0.000);且 PH 6.0 + KN-93 组较 PH 7.4 组(14±2.8)c-FOS阳性细胞数增多,差异有统计学意义(t=14.565,P=0.000);Western blotting示PH6.0组p-CaMKⅡ/CaMKⅡ比例高于PH7.4组(2.9±0.3)倍,差异有统计学意义(t=-10.595,P=0.000);PH6.0 + KN-93 组 p-CaMKII/CaMKII 比例相对于PH6.0组减少了(0.55±0.05)倍,差异有统计学意义(t=15.731,P=0.000)。结论:1.反复间断酸性刺激小鼠硬脑膜可建立慢性偏头痛模型;2.ASICs通道而非TRPV1通道参与了酸诱导的慢性偏头痛模型形成;3.在酸诱导的慢性偏头痛模型中,酸激活了硬脑膜传入纤维的ASICs通道,进一步激活P/Q型钙通道,通过CaMKⅡ磷酸化,激活CaMKⅡ/cAMP反应元件结合蛋白(CREB)通路,调控疼痛基因c-FOS的表达。