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稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起水稻稻瘟病,严重威胁水稻产量及质量安全,稻瘟病的防控对于保障水稻稳产及水稻品质尤为重要。稻瘟病菌基因的功能解析能为稻瘟病的防治提供理论依据,目前真菌生物学研究已进入功能基因组时代,反向遗传学方法是研究基因功能最直接简便的方法。本研究利用同源重组技术,以双荧光标签为负性筛选标记优化了根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化体系,建立了稻瘟病菌高通量基因敲除系统,为稻瘟病菌基因功能研究提供了有效的技术支撑。同时,为挖掘稻瘟病菌与水稻互作过程中侵染及免疫相关的互作蛋白,针对稻瘟病菌和水稻,分别构建了侵染阶段各自的酵母双杂交cDNA文库,可运用于互作蛋白的筛选及鉴定,为明确稻瘟病菌与水稻的互作机理奠定了基础。本文的第一部分优化了根癌农杆菌介导稻瘟病菌高通量基因敲除系统,并据此遗传转化系统进行了候选基因的敲除及应用评价。第二部分构建了稻瘟病菌与水稻侵染阶段各自的酵母双杂交cDNA文库,并对两个cDNA文库进行了质量评价。1.关于根癌农杆菌介导的稻瘟病菌基因敲除方法,获得主要结果如下:(1)成功构建酵母-大肠杆菌-农杆菌三元穿梭载体pCAMBIA1300ura,并通过此载体构建了验证载体pCAMBIA1300ura-GFP-HYG。(2)用四种根癌农杆菌菌株AGL-1、C58、GV3101、LAB4404对验证载体pCAMBIA1300ura-GFP-HYG进行转化效率和转化子阳性率验证,发现AGL-1为最优转化菌株。(3)针对黑色素合成相关基因MoBUF1,构建双荧光负向筛选敲除载体,利用根癌农杆菌AGL-1对MoBUF1进行基因敲除,随机挑取144个转化菌株,有108个转化子表现为潮霉素抗性,其中78个转化菌株带有GFP或RFP标记,而30个转化菌株颜色表现为黄色并且不带任何荧光标记。对这些不带荧光的转化菌株进行PCR验证,发现其中29个均是由同源重组产生的正确ΔMobuf1敲除突变体,这说明双荧光负向筛选获得敲除突变体的效率可达26.7%。(4)利用根癌农杆菌介导真菌转化系统对多个稻瘟病菌基因进行敲除转化。对MGG＿03250的敲除效率为32%,对MGG＿05096的敲除效率为35%,对MGG＿04972的敲除效率为28%,对MGG＿00381的敲除效率为48%,对MGG＿01732的敲除效率为37%,对MGG＿10601的敲除效率为25%,对lnc59265的敲除效率为28%,对MGG＿06375的敲除效率为66.7%。2.关于稻瘟病菌与水稻酵母双杂交cDNA文库的构建评价,获得结果如下:(1)于疏水性玻片上观察稻瘟病菌Guy11菌株的附着胞发育,发现分生孢子在4 h开始形成附着胞,8 h附着胞黑色素化,12 h分生孢子出现自噬性凋亡,24 h附着胞完全成熟。收集各阶段附着胞,提取总RNA,分离纯化mRNA,构建稻瘟病菌c DNA文库,其库容量为1.0×10~7CFU/m L,插入片段平均长度为1.5kbp,重组率为100%。(2)利用过表达绿色荧光蛋白GFP的稻瘟病菌菌株Guy11-GFPox对高抗材料地谷(Digu)与高感材料丽江新团黑谷(LTH)进行接菌侵染观察,发现在侵染0-16 h,两者之间没有差异,从侵染20 h开始,Guy11-GFPox在LTH中开始形成大量侵染菌丝,在Digu中出现极少量侵染菌丝。收集喷雾接种Guy11的Digu叶片,提取总RNA,分离纯化mRNA,构建水稻cDNA文库,其库容量为1.2×10~7CFU/mL,插入片段平均长度为1.5 kbp,重组率为100%。