疟疾目前仍然是严重威胁人类健康的寄生虫病, 在四种人体疟原虫中，恶性疟原虫是引起严重疟疾病症乃至死亡的主要病原体。由于疟原虫抗药性以及蚊媒抗杀虫剂的抗性产生，使疟疾防治面临严重困难。因此，研制有效的疟疾疫苗已成为疟疾防治的重要替代途径。 由于疟原虫的生活史复杂、抗原具有期特异性和变异性以及宿主MHC限制性，一个有效的疟疾疫苗应由多期多种抗原组成。本研究旨在构建这种多期多价疫苗并探讨其免疫原性。我们实验室已构建了由AMA-1(III)和MSP1-19组成的恶性疟原虫红内期融合抗原PfCP-2，并在毕氏酵母中得到了高水平表达。免疫实验结果显示，PfCP-2保留一些重要构象表位，能在动物体内产生较高的抗体滴度，且其免疫血清在体外能完全抑制疟原虫的生长。然而，PfCP-2的表达产物在 SDS-PAGE电泳图上表现为两条表达带。通过对两条带的N-末端氨基酸序列分析，发现两条带的原因是由于其中一条带N-末端缺失9个氨基酸残基。对此，本研究对PfCP-2的基因进行改建，去除其N末端前9个氨基酸的编码序列，产生新的基因定名为PfCP-2.9。该基因在毕氏酵母中的表达产物表现为一条带，表达水平与PfCP-2相近（在1克/升以上）。此外，PfCP-2.9在理化性质、免疫原性及免疫血清抑制疟原虫生长方面与PfCP-2一致。这表明在N-末端去除9个氨基酸不影响该融合抗原的免疫原性及其免疫血清的体外抑制作用。这为该疫苗抗原解决了在诸如产品申报、临床试验中因两条表达带而带来的麻烦。 通过比较实验，本研究结果显示：与组成该融合蛋白的两个单组分[即AMA-1(III)和MSP1-19]相比，PfCP-2.9具有以下优势：①表达产量比单组分高20倍；②免疫家兔的抗体滴度分别是两个单组分的11倍和18倍；③15%的PfCP-2.9免疫血清能有效抑制疟原虫生长，而相同浓度的单组分免疫血清无抑制作用。这表明将两个单组分融合为一个分子后，其表达量、免疫原性以及免疫抑制作用均有显著提高。 为了构建一个有效的多期多价疟疾疫苗，在PfCP-2.9基础上增加红外期抗原。对此，本研究构建了另外3个红前期抗原。这些抗原包括：①PfCP-3tcl：它由恶性疟原虫红前期CSP、TRAP和LSA-1抗原中主要T、B细胞表位融合而成；②<WP=5>PfCSP-1：由恶性疟原虫CSP抗原的C-末端序列组成；③PfCSP-2由恶性疟原虫CSP抗原中区域I、15个四肽重复区和全部C-末端序列组成。以上3个抗原均从基因水平设计和合成，并选用毕氏酵母密码子和排除抗原中糖基化位点。3个合成基因均能在毕氏酵母系统中进行分泌表达，产量均在1克/升以上，高的可达4克/升。纯化蛋白均采用阳离子交换和分子筛两步法，获得纯度在95%以上的重组蛋白。将3个纯化蛋白分别与PfCP-2.9进行联合免疫，测定针对各抗原的抗体滴度，并与单个抗原免疫的抗体滴度比较。结果显示：PfCP-3tcl与PfCP-2.9联合免疫的抗体滴度均比单个抗原免疫的滴度有明显下降，可能存在抗原竞争性抑制作用；而PfCSP-1和PfCSP-2分别与PfCP-2.9联合免疫后均未发现有明显的竞争性抑制作用，其抗体滴度与单抗原免疫血清相当或有所上升。这样，本研究结果初步表明，PfCSP-1或PfCSP-2可与PfCP-2.9组成多期多价联合疫苗。对该多期多价疟疾疫苗的进一步试验(包括恒河猴试验)目前正在进行和安排之中