论文部分内容阅读
氮循环（Nitrogen Cycle）作为地球上重要的生物地球化学循环系统之一,与生物的生命活动息息相关,其在农业生态系统中的重要地位更是不言而喻。然而,随着人类活动的介入,如过度施用氮肥等,不仅造成了氮素资源浪费或环境超负荷,也导致地下水污染,以及河流、湖泊富营养化严重。因此,合理开发和利用生物固氮菌,从而减少化学氮肥施用量,对于保护生态环境,促进农业的可持续生产具有十分重要的意义。本研究以从玉米根际分离筛选得到的联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A为研究对象,通过PCR法克隆得到了GXGL-4A菌株的亚硝酸还原酶基因nir BD,并明确了编码亚硝酸还原酶的基因在GXGL-4A菌株中是双拷贝的,但其结构不同。通过设置不同的NO3–和NO2–浓度梯度,发现在LB培养基和A15无氮培养基中,不同氮素浓度对GXGL-4A菌株的生长情况和亚硝酸还原酶活性的影响程度有所不同。通过构建重组质粒p MOD-egfp-tet,并利用电击转化法将转座复合体导入GXGL-4A野生株中,得到了大量Tn5转座突变株。初步建立了GXGL-4A菌株稳定有效的插入突变技术体系及突变文库。通过对筛选得到的GXGL-4A的Tn5转座突变株的亚硝酸还原酶活性、生长情况以及固氮酶活性测定后,获得了能使GXGL-4A亚硝酸还原酶活性显著降低的突变株,并对GXGL-4A的固氮作用和亚硝酸还原过程（硝酸盐还原过程的第二步）之间的相互关系有了初步的认识。同时,克隆得到了突变株M36、M386和M481的侧翼序列,确定了这3个突变株的突变位点。将具有GFP荧光蛋白标记的GXGL-4A菌株接种于黄瓜植株中,发现黄瓜植株的根冠和根毛区是菌株的主要侵入点。GXGL-4A菌株在近地面根部皮层细胞定殖的数量高于近根冠处的数量。同时,GXGL-4A菌株也能够在细胞间隙和导管中定殖,并具有明显的聚集效应。除此之外,研究还表明GXGL-4A菌株对黄瓜植株有一定的促生作用,其中,GXGL-4A菌株浓度为105CFU/m L时对黄瓜植株整株的促生作用最为显著（P<0.01）。通过对在富氮和限氮两种条件下差异转录组结果进行分析后,并结合前面测得的固氮酶活性和亚硝酸还原酶活性,发现在限氮条件下GXGL-4A菌株固氮酶相关基因的表达显著下调。同时,其亚硝酸还原酶相关基因nir18800基因表达显著下调,而nir22885和nir22890两个基因表达则显著上调。本研究为解析亚硝酸还原酶Nir BD在维持氮循环内稳态中的调控作用,以及为阐明硝酸盐异化还原成铵（DNRA）与固氮作用等其他氮循环过程之间的互作关系奠定了坚实的基础,也为将GXGL-4A菌株开发成生物菌剂以应用于农业生产实际提供了理论指导。