研究背景：急性白血病(acute leukemia, AL)是最常见的恶性肿瘤之一,以疾病发展迅速,骨髓和(或)外周血中存在大量停留在较早期阶段的原始细胞及早期幼稚细胞为特点。在成人急性白血病中,又以急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)多见。目前AML治疗仍以化疗为主(急性早幼粒细胞白血病除外),初始治疗的标准诱导化疗方案可以使完全缓解(complete remission, CR)率达60%-80%以上。然而,只有20%～30%的患者能够获得长期无病生存,超过50%的患者仍终将复发,一旦复发,死亡率显著增加。急性白血病患者的5年生存率在中青年患者中只有40%,老年患者则低于10%。复发、难治和老年白血病是目前急性白血病治疗的主要问题[241。另外,相合／半相合无关供者或不相合有关供者的造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)已经成为AML的治疗方案之一,同种异体自然杀伤(alloreacctive natural killer, allo-NK)细胞的同种异体反应性也被认为可以显著降低人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)半相合HSCT后的AML复发率。但NK细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immunoglobulin-like receptors, KIR) 2DL1表达率及其KIR2DL1-HLA通路相关性的分析仍未阐明。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase, RTK) ErbB家族的成员,在肿瘤发生、发展中的异常高表达,使它成为抗肿瘤有效的候选靶点。然而,对EGFR抑制剂内源性及获得性耐药,也成为日趋关注的问题。近年来,EGFR近膜区(juxtamembrane domain, JMD)对EGFR的活化和调控作用,也越来越受到关注,尤其是变构酪氨酸激酶活性调控方面。研究人员发现,当近膜区被无关序列替代后,EGFR的酪氨酸残基不再磷酸化。尽管其他RTK的JMD普遍参与自我抑制的相互作用,EGFR近膜区的活化作用是独一无二的,因为它开辟了EGFR靶向治疗的崭新途径。另外,在EGFR活化过程中,JMD可以稳定酪氨酸激酶的不对称二聚体。Boran和Bennasroune等人设计了源于EGFR近膜区的肽类抑制剂,并发现可以下调EGFR下游通路。根据2015年American Society of Clinical Oncology(美国临床肿瘤协会,ASCO)的最新数据表明,以HER2、PD-1、HER3、EGFR为代表的蛋白位点是各个公司研究抗肿瘤药的主要靶点,EGFR在肿瘤细胞恶性增殖过程中有着重要的作用。EGFR包括三个主要部分,胞外区(ECD 1-620),跨膜区(TCD621-644)和胞内区(ICD 645-1186),其中胞内区又由JMD(645-682),激酶区(kinase domain, KD,683-954)和C尾端(C-terminal tail 955-1186)三部分组成。EGFR抑制剂大致分为三代：第一代吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)在临床上获得了巨大成功,但大多数患者在1-2年内发生耐药,约60%患者产生耐药是因为发生了EGFR 790T→M突变；第二代阿法替尼(Afatinib)和达克替尼(Dacomitinib),未能克服上述耐药性而在临床试验中失败；第三代新药ADZ9291和Rociletinib在临床试验中均获得了显著疗效,对于接受过EGFR抑制剂治疗而发生耐药基因EGFR 790T→M突变的晚期非小细胞肺癌患者已取得初步的临床疗效。近十年来,基于对蛋白质空间结构和生理功能的理解,治疗白血病的药物越来越有针对性。计算机技术的引入对肿瘤靶向设计提供了技术支持。一些药物辅助设计软件如Sybyl、AutoDock等日益成熟,并广泛地用于新药设计,发现了一批与AML发生和发展密切相关的基因并研发了许多针对明确致癌基因或位点的药物,在细胞水平上攻击白血病细胞,如单克隆抗体,酪氨酸激酶抑制剂,法尼基转移酶抑制剂,去甲基化药物,组蛋白去乙酰化酶等。因此,面对急性白血病日益增高的发病率以及以分子靶向治疗和分层治疗的成功,阐明AML新的发病机制特别是针对急性白血病特异性分子改变进行有力的干预,对于改善治疗效果十分重要。表皮生长因子受体通路底物8(Epidermal growth factor receptor pathway substrate No.8, EPS8)是EGFR激酶的重要底物,可以特异性的结合EGFR近膜区。EPS8全长821个氨基酸,包括PTB区域、SH3区域以及SAM-PNT区域。它还包括两个额外的功能性区域：(1)C端效应区(aa：641-821),其可结合Sos-1,活化Rac特异性鸟嘌呤交换因子(GEF)；(2)EGFR结合区(aa:296-362),提供EGFR近膜区的结合表面。EPS8在各种实体肿瘤(如宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌、口腔鳞状细胞癌、垂体瘤、胰腺导管癌、食道癌等)[19-22]及血液系统肿瘤(如多发性骨髓瘤、AML、ALL等)[23]中异常高表达。研究发现,EPS8对肿瘤发生、发展、迁移及转移密切相关,并且是癌症病人不良预后的的生物学标志[24-28]。然而,EPS8在血液系统肿瘤特别是AML当中的作用尚不明确,国内外研究鲜见报导。我们前期研究也对EPS8在不同肿瘤生物学行为中的作用进行了全景描述,并且提出EPS8可能成为肿瘤预防及治疗的一个潜在靶点。另一方面,NK细胞是机体天然免疫的主要承担者,在杀伤靶细胞过程中,杀伤细胞KIR传导抑制信号,其配体为HLA I类分子,该信号能阻断杀伤信号的传递。其中,参与的主要KIRs分别是识别HLA-C2群位点的KIR2DL1以及识别HLA-C1群位点的KIR2DL2/3,且这两种KIR配体主要是由门冬酰胺或赖氨酸的蛋白序列位点80区分的。Niu等人也认为NK细胞杀伤KGla细胞机制主要源于KIR-HLA错配[5,6,29,301。因此,本研究也旨在确认在allo-NK细胞杀伤KGIa细胞作用中,是否存在KIR2DL1-HLA通路传导抑制性信号。综上所述,本研究主要包含三方面工作：首先,我们发现PI3K/AKT通路可能在EPS8相关AML细胞增殖、凋亡及耐药方面起到重要作用。其次,基于EPS8蛋白结构中的EGFR结合区,我们设计了一种新型的抗AML短肽抑制剂。针对AML细胞系,该短肽抑制剂具有显著抗增殖、促凋亡、提高药敏性的作用。最后,我们证实了KGla细胞表面存在HLA-C2群位点,识别抑制性信号KIR2DL1,使得KIR2DL1-HLA信号通路抑制NK细胞杀伤KGla细胞。目的：1、计算机辅助药物设计(computer aided drug design, CADD)技术简介及EPS8过表达稳定细胞株构建2、利用CADD技术,设计并合成抗AML靶向短肽ETP-39043、检测ETP-3904抗AML活性及机制探究4、验证KIR2DL1-HLA信号通路抑制allo-NK细胞杀伤KGIa细胞方法：1、ETP-3904设计思路：以EPS8上的EGFR结合域的核心功能结构为基础,并采用CADD技术,进行分子对接及分子动力学模拟等工作。经优化与筛选后,获得先导短肽序列。2、ETP-3904体外活性验证：激光扫描共聚焦显微镜观察ETP-3904穿膜活性；MTT法检测ETP-3904对白血病细胞及正常细胞的杀伤活性；流式细胞术检测ETP-3904对6种AML细胞株凋亡及周期的影响；药物联合试验检测ETP-3904对传统化疗药物(DNR, Ara-c, Perifosine)敏感性的影响。3、ETP-3904作用机制：利用Western blot进一步探究ETP-3904可能作用机制,检测EGFR下游的Akt、Erk及Stat3等信号分子的磷酸化水平。4、KIR2DL1-HLA抑制性通路：利用磁珠活化细胞分选(magnetic activated cell sorting, MACS)12例健康供者外周血的NK细胞；流式细胞术评估NK细胞表面KIR2DL1表达率；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放法分析NK细胞对KGla细胞杀伤率。结果：1、ETP-3904设计思路：分子对接与分子动力学模拟结果显示,ETP-3904可以稳定结合于EGFR JMD。2、ETP-3904体外活性验证：激光扫描共聚焦显微镜下显示ETP-3904具有穿过KGIa细胞膜的能力,并且能够进一步穿过核膜作用于细胞核。在细胞毒效应方面,通过MTT法证实ETP-3904可选择性杀伤白血病细胞,而对正常细胞杀伤作用微弱。同时利用流式细胞术对药物作用后的6种AML细胞进行分析发现,ETP-3904还具有诱导细胞凋亡,使细胞周期阻滞于G2-M期的作用。在逆转耐药方面,与多种化疗药物的联合试验发现ETP-3904可以显著提高AML细胞对常规药物(DNR,Ara-c, Perifosine)的敏感性,并且通过Chou-Talalay法进行分析证实,ETP-3904与常规化疗药物联合指数(combination index, CI)<1,具有协同作用。3、ETP-3904作用机制：发现ETP-3904可以引起EGFR下游的Akt、Erk及Stat3等信号分子的磷酸化水平下降。4、KIR2DL1-HLA抑制性通路：12例供者KIR2DL1表达率具有显著差异(27.14%～92.49%)。低KIR2DL1表达率的NK细胞杀伤KGla细胞活性更高,而高KIR2DL1表达率的NK细胞杀伤KGIa细胞活性更低(R2=0.8169,p<0.05)。结论：1、ETP-3904设计思路：成功设计并合成新型抗AML短肽ETP-3904。2、ETP-3904体外活性验证：ETP-3904具有显著穿膜、抗增殖、促凋亡、抑周期、提高药敏性等抗AML活性。3、ETP-3904作用机制：根据Western Blot结果,推测ETP-3904抗AML作用可能通过下调PI3K/AKT通路和ERK通路导致。4、KIR2DL1-HLA抑制性通路：KIR2DL1表达率与NK细胞杀伤KGla细胞呈负相关性。