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研究背景和目的:几乎所有的血管外科疾病及其治疗方法都涉及血管内皮细胞(VEC),比如血栓形成、炎症、球囊扩张、支架植入等都会直接损伤血管内皮细胞,血管内皮细胞作为血管腔和周围组织之间的屏障,保持其正常的功能对生物个体非常重要,在血管结构重塑、血流调节、物质交换、防止脂质渗漏、抑制血小板聚集、血栓形成等方面发挥关键作用。研究血管内皮细胞损伤下的各种机制对临床很有意义。内皮细胞有高度发达的内质网(ER),在细胞受损伤的情况下,如缺氧、损伤、血栓形成及感染等,很容易导致大量错误折叠蛋白的积累,导致内质网应激(ERS)。ERS主要包括三种信号通路:非折叠蛋白反应(UPR)、固醇调节级联反应及内质网超负荷反应(EOR),其可帮助维持细胞内稳态,但持续的ERS将会导致细胞凋亡。UPR是ERS通路中最为重要的通路。UPR是由免疫球蛋白重链蛋白(BiP)/葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和三种ERS传感器蛋白介导,分别是IRE-1、PRER和ATF6。其中,ATF6是ER膜外的2型跨膜蛋白激酶,为调控ERS,其从ER转移到高尔基体,并裂解转录激活的p50ATF6。活化的p50ATF6可结合细胞核中ERS反应因子,诱导ERS相关基因表达,如C/EBP同源蛋白质(CHOP)、DNA损伤诱导基因153(GADD153)、X盒结合蛋白1(XBP1)等,并调控细胞生存或凋亡。虽然最近的研究发现活化的ATF6在不同细胞中的调节途径不尽相同,但是对于ERS状态下的血管内皮细胞凋亡的具体机制仍不明确,因此我们在本研究中探究在ERS状态下血管内皮细胞中ATF6是否能诱导凋亡,且是通过哪些途径实现的。我们用毒胡萝卜素(TG)作为ERS诱导剂,造成血管内皮细胞的ERS,再研究ATF6对ERS状态下的血管内皮细胞凋亡的影响并寻找可能的机制,为调节ERS状态下血管内皮细胞的凋亡提供一些基础和可能性。研究方法:1.毒胡萝卜素诱导血管内皮细胞的内质网应激,建成细胞模型,ATF6质粒转染,分组为:对照组、TG组、ATF6(151-366aa)+TG组、ATF6(1-366aa)+TG组;2.检测ATF6对内质网应激状态下的血管内皮细胞的增殖及凋亡能力的影响;3.检测ATF6对内质网应激状态下血管内皮细胞的caspase-3、caspase-4、caspase-9、caspase-12、CHOP、Cyt C表达水平的影响;4.检测ATF6对内质网应激状态下血管内皮细胞的Bax,Bcl-2表达水平的影响;5.检测ATF6对内质网应激状态下血管内皮细胞的pro-caspase-8、cleaved-caspase-8和Fas的表达。研究结果:1.ATF6(1-366aa,ATF6高表达质粒)转染的细胞ATF6高表达:用印迹检测ATF6蛋白的表达检测试转染效率,ATF6(1-366aa)组的蛋白质是ATF6(151-366aa,无转录活性的质粒)组和其他对照组的5倍(P<0.01)。2.TG处理48小时降低了血管内皮细胞的活力:与对照组相比,TG诱导的ER应激组受到抑制。ATF6(1-366aa)+TG细胞对ER应激最敏感,表现出最低的活力。TG处理后的细胞活力以时间依赖性方式降低。此外,当细胞用TG处理48小时时,各组之间存在显着差异(P<0.01或P<0.05)3.TG处理显著增加血管内皮细胞凋亡率:与对照组相比,3个TG处理组细胞凋亡率增加,特别是ATF6(1-366aa)转染细胞,从5.50±0.43增加到37.41±2.99 5%(P<0.01)。此外,ATF6(1-366aa)+TG组的凋亡率是TG组和ATF6(151-366aa)+TG的2.5倍。4.活化的ATF6的高表达增加了caspase?3,caspase?4,caspase?9 and caspase?12的活化以及PARP的裂解:与对照组相比,TG处理增加了VEC中caspase-3,caspase-4,caspase-9,caspase-12和PARP的裂解(P<0.01)。在ATF6(1-366aa)+TG组活性ATF6过表达,裂解的caspase-3,caspase-4,caspase-9,caspase-12和PARP的蛋白水平显着高于TG组和ATF6(151-366aa)+TG组(P<0.01)。5.活化的ATF6的高表达增加CHOP、Cyt c和Bax的表达,但导致Bcl-2蛋白水平降低:TG处理48h后用RT-PCR和蛋白质印迹分析凋亡相关蛋白的表达水平,三个TG组、与对照组相比,CHOP和cyt c的mRNA和蛋白水平均升高(P<0.05)。这些mRNA和蛋白在ATF6(1-366aa)+TG组中的表达与TG和ATF6(151-366aa)+TG组中的表达显着不同(P<0.01)。TG处理可下调Bax mRNA和蛋白表达水平,而Bcl-2表达水平下调(P<0.01)。在ATF6过表达细胞中,CHOP和Bax的mRNA表达和蛋白质水平几乎是其他TG组的两倍,而cyt c水平则是三倍。ATF6的上调导致Bcl-2的表达降低。6.ATF6活化可促进JNK/NF-κB表达量增加及磷酸化水平升高:通过蛋白质印迹检测总NF-κB。TG处理后p-JNK/JNK的比例显着增加(P<0.01)。在ATF6(1-366aa)+TG组,JNK的磷酸化水平进一步升高(P<0.01)。在TG处理后也观察到NF-κB蛋白水平上升,特别是在活性ATF6高表达的细胞中,其中NF-κB的蛋白质水平与TG和ATF6(151-366aa)+TG相比几乎翻倍(P<0.01)。7.在死亡受体相关基因的表达中没有发现TG处理和ATF6上调的显着影响:使用PCR和蛋白质印迹测定Fas mRNA和蛋白质。结果显示,对照组,TG,ATF6(151-366aa)+TG和ATF6(1-366aa)+TG组的表达无显着差异(P>0.05)。此外,pro-caspase-8 and cleaved-caspase-8的蛋白质水平不受TG处理和ATF6表达的影响(P>0.05)研究结论:1.毒胡萝卜素诱导内质网应激并引起血管内皮细胞凋亡,而活化的ATF6加剧了内质网应激诱导的凋亡。2.高表达的活化的ATF6通过线粒体凋亡途径加重内质网应激状态下的血管内皮细胞凋亡。3.内质网应激诱导的血管内皮细胞凋亡可能不是通过死亡受体信号通路,而且高表达的活化的ATF6不会影响相关基因的表达。