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目的:1、初步鉴定猪苓中提取的一种均一多糖的初级结构和理化性质。2、复制BBN膀胱癌大鼠模型,探索猪苓对其膀胱组织病理结构及相关蛋白表达的影响。3、探讨猪苓对肿瘤微环境中巨噬细胞极化在基因和信号通路的分子作用机制。4、探讨猪苓对肿瘤微环境中M1亚型巨噬细胞的表型和炎症因子分泌的影响及其可能的分子机制。方法:1、通过水加热法从猪苓药材中提取得到猪苓总多糖,利用醇沉和Sevag法除去猪苓粗多糖中的蛋白质成分,DEAE-52法除去粗多糖中色素等非糖杂质,并采用Sephadex G-100凝胶柱法进一步分离得到一个新的均一猪苓多糖(homogeneous polyporus polysaccharide,HPP)。采用紫外光谱扫描和硫酸—苯酚法检测总多糖的含量,通过相关分子质量测定、红外分析、核磁共振分析等方法对均一猪苓多糖的初级结构进行解析。2、复制BBN(N-丁基-N-(4-羟基丁基)亚硝胺(N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosam ine,BBN)膀胱癌大鼠模型,36只大鼠分为空白组、模型组、猪苓水提取液(water decoction of polyporus,WDP)组和猪苓多糖(polyporus polysaccharide,PPS)组,给予药物干预后,每天测量大鼠的体重变化,取材之后,切片进行HE和免疫组化染色,观察大鼠膀胱的病理结构和相关蛋白的表达情况。3、体外实验在共培养(巨噬细胞+T24膀胱肿瘤上清液)和非共培养条件下进行,设立对照组、共培养对照组、IFN-γ组、共培养IFN-γ组、给药组和共培养给药组。MTT法检测猪苓水提取液和猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞增殖活力的影响;Griess法测定猪苓水提取液和猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞以及猪苓多糖对M1亚型RAW264.7巨噬细胞NO分泌的影响;Real time PCR法检测猪苓水提取液和猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞以及猪苓多糖对M1亚型RAW264.7巨噬细胞炎症基因INOS、IL-6、TNF-α和IL-1 β表达的影响;液态蛋白芯片法检测猪苓水提取液和猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞IL-6、IL-23、RANTES、MCP-1、MIP-1 α、MIP-1 β、TNF-α 和IL-1 β 以及猪苓多糖对M1亚型RAW264.7巨噬细胞TNF-α、IL-23、IL-6和RANTES炎症因子分泌的影响;流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞CD86和CD40以及对M1亚型RAW264.7巨噬细胞CD40、CD86和CD284膜分子表达的影响;免疫荧光和流式细胞术检测猪苓多糖对M1亚型RAW264.7巨噬细胞吞噬功能的影响;免疫印迹法检测猪苓水提取液和猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞核转录因子NF-KB成员Cox2、INOS、IKB-α和P65-NF-KB蛋白及信号转导与转录激活子STAT3成员STAT3、P38和JNK蛋白表达的影响。另外,猪苓多糖对M1亚型RAW264.7巨噬细胞Cox2、INOS、IKB-α和P65-NF-K B蛋白的表达也进行了检测。4、实验分为对照组、共培养对照组、IFN-γ组和1、10、100 μ g/mL均一猪苓多糖组。MTT法检测均一猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞增殖活力的影响;Griess法测定均一猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞NO分泌的影响;Real time PCR法检测均一猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞炎症基因INOS、IL-6、TNF-α和IL-1 β表达的影响;液态蛋白芯片法检测均一猪苓多糖对RAW264.7巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-23、RANTES、MCP-1、MIP-1 α、MIP-1 β、TNF-α和IL-1 β分泌的影响;流式细胞术检测均一猪苓多糖对 RAW264.7 巨噬细胞膜分子 CD16/32、CD40、CD11b、CD282、CD14 和 CD284 以及对M1亚型RAW264.7巨噬细胞CD282和CD80表达的影响;免疫印迹法检测均一猪苓多糖对RAW264.7和THP-1巨噬细胞(由人THP-1单核细胞诱导而成)NF-KB/NLRP3通路成员 IK B-α、IKK α/β、TAK1、Cox2、INOS、P50、P65-NF-K B、NLRP3 和 Caspase-1蛋白,STAT3/P38MAPK通路成员JAK2、STAT3、P38和JNK蛋白以及对M1亚型RAW264.7巨噬细胞NF-KB通路成员 IKB-α、IKKα/β、TAK1、Cox2、INOS、P50 和 P65-NF-KB蛋白表达的影响;添加P65-NF-KB蛋白特异性抑制剂SC75741,免疫印迹法检测RAW264.7巨噬细胞和THP-1巨噬细胞NF-KB/NLRP3通路成员IKB-α、IKKα/β、TAK1、Cox2、INOS、P50、P65-NF-KB、NLRP3 和 Caspase-1 蛋白的表达情况;添加STAT3蛋白特异性抑制剂T2418,免疫印迹法检测RAW264.7巨噬细胞和THP-1巨噬细胞STAT3/P38MAPK通路成员JAK2、STAT3、P38和JNK蛋白的表达情况,液态芯片法检测RAW246.7巨噬细胞炎症因子IL-23、MCP-1和IL-6的分泌情况。结果:1、采用热水提取得到猪苓粗多糖,醇沉,Sevag法除蛋白制备猪苓总多糖,DEAE-52脱色素,Sephadex G-100凝胶柱分离精制得到一个新的均一猪苓多糖。鉴定发现其组成只有单糖葡萄糖,构型均为α型,主要连接方式为1→4连接。2、体内实验发现,BBN晚期膀胱癌模型大鼠的体重下降较快,而猪苓水提取液和猪苓多糖组大鼠的体重有上升趋势。与模型组相比,猪苓水提取液和猪苓多糖组的膀胱组织中CD163蛋白表达减少,而膀胱肿瘤微环境中炎症因子IL-6和INOS蛋白表达增加。3、在肿瘤微环境和非肿瘤微环境条件下,猪苓水提取液和猪苓多糖增加了RAW246.7巨噬细胞NO的分泌量;增加了RAW246.7巨噬细胞炎症因子INOS、IL-6、TNF-α和IL-1 β mRNA的表达量;增加了RAW246.7巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-23、RANTES、MCP-1、MIP-1 α、MIP-1 β、TNF-α 和IL-1 β 的分泌量;增加了RAW246.7巨噬细胞NF-KB信号通路成员IKB、P65-NF-KB、Cox2和INOS蛋白以及STAT3通路成员STAT3、P38和JNK蛋白的表达。提示了猪苓水提取液在肿瘤微环境和非肿瘤微环境条件下,具有使RAW246.7巨噬细胞向M1亚型极化的趋势,可能是通过NF-KB、STAT3/P38MAPK通路激活巨噬细胞。进一步实验结果发现猪苓多糖增强了 M1亚型RAW246.7巨噬细胞的吞噬功能;上调M1亚型RAW246.7巨噬细胞炎症因子IL-6和TNF-αmRNA的表达量;上调M1亚型RAW246.7巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-23、IL-6和RANTES的分泌量;上调M1亚型RAW246.7巨噬细胞膜分子CD40、CD86和CD284的表达量;上调了M1亚型RAW264.7巨噬细胞的NF-KB通路成员IKB-α、Cox2、INOS和P65-NF-KB蛋白表达。提示了猪苓多糖在肿瘤微环境和非肿瘤微环境条件下,具有使M1亚型RAW246.7巨噬细胞进一步向M1极化的趋势。4、在肿瘤微环境条件下,均一猪苓多糖呈现浓度依赖性上调RAW246.7巨噬细胞NO的分泌量;呈现浓度依赖性上调RAW246.7巨噬细胞炎症因子INOS、IL-6、TNF-α和IL-1 β mRNA的表达量;呈现浓度依赖性上调RAW246.7巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-23、RANTES、MCP-1、MIP-1 α、MIP-1 β、TNF-α和IL-1 β的分泌量;呈现浓度依赖性上调RAW246.7巨噬细胞CD16/32、CD40、CD14、CD284、CD282和CD11b以及M1亚型RAW246.7巨噬细胞CD282和CD80膜分子的表达量;呈现浓度依赖性上调RAW246.7和THP-1巨噬细胞NF-K B/NLRP3通路成员 IK B-α、IKK α/β、TAK1、Cox2、INOS、P50、P65-NF-K B、NLRP3和Caspase-1 蛋白,STAT3/P38MAPK通路成员JAK2、STAT3、P38和JNK蛋白以及M1亚型RAW264.7巨噬细胞NF-KB通路成员IKB-α、IKKα/β、TAK1、Cox2、INOS、P50和P65-NF-KB蛋白的表达量。抑制P65-NF-KB蛋白,均一猪苓多糖上调RAW246.7和THP-1巨噬细胞P65-NF-KB、P50、TAK1、IKB-α和IKKα/β蛋白的趋势被逆转;并且均一猪苓多糖上调RAW246.7和THP-1巨噬细胞NLRP3通路成员NLRP3和Caspase-1蛋白的趋势也被逆转了。抑制STAT3蛋白,均一猪苓多糖上调RAW246.7和THP-1巨噬细胞STAT3/P38MAPK通路成员JAK2、STAT3、P38和JNK蛋白的趋势被逆转,并且均一猪苓多糖上调RAW246.7巨噬细胞炎症因子IL-23、MCP-1和IL-6的趋势也被逆转了。提示了均一猪苓多糖在肿瘤微环境条件下极化巨噬细胞是通过NF-KB/NLRP3和STAT3/P38MAPK通路轴起作用,并具有使M1亚型RAW246.7巨噬细胞进一步极化的作用。结论:1、通过一系列分离提取程序得到一个均一猪苓多糖。2、猪苓治疗膀胱癌的作用机制与肿瘤微环境中巨噬细胞的极化相关,猪苓水提取液和猪苓多糖均能极化巨噬细胞成为M1亚型,可能是通过NF-KB和P38MAPK通路激活巨噬细胞,猪苓多糖还能增加M1亚型巨噬细胞炎症因子及表型的表达。3、均一猪苓多糖在肿瘤微环境条件下能够通过NF-KB/NLRP3和STAT3/P38MAPK通路轴激活巨噬细胞,成为M1亚型,并增加M1亚型巨噬细胞CD80和CD282等膜表型分子的表达。