目的 卵巢癌化疗中，顺铂(cisplatin, CDDP)应用普遍，但相关抗药性问题也越来越突出。因此，选择能有效与之配伍的药物是临床探索的问题之一。阿克拉霉素(aclarubicin, ACR)作为拓扑异构酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ,topoⅡ)抑制剂之一，在卵巢癌的治疗中使用较少，并且与CDDP合用时相互作用机理尚不明确。为此，本研究通过ACR与CDDP联合用药的体外实验，旨在探讨卵巢癌化疗药物组合，为筛选有效抗肿瘤药物提供依据。材料和方法1材料 卵巢浆液性囊腺癌（SKOV3）细胞株引自北京大学人民医院。ACR为深圳万乐药业有限公司产品。CDDP为昆明三戎金属药业有限公司产品。免疫细胞化学试剂，一抗为鼠抗人topoⅡ抗体（美国Sandcruz公司），辣根过氧化物酶(HRP)标记的生物素化二抗购自武汉博海生物公司。RPMI-1640培养基、噻唑蓝(MTT)、RNA酶、蛋白酶K、中分子量蛋白标准、吖啶橙、嗅乙啶购自华美公司。2 方法2.1 细胞培养和药物作用浓度选择SKOV3细胞以RPMI-1640培养基培养，内含10%新生牛血清、青霉素100 U/ml、链霉素100μg/ml，置37℃、5% CO2环境下培养。应用药物的血浆峰浓度(peak serum concentration, PSC)，其中ACR为6μg/ml；CDDP为3μg/ml进行相应实验分组。2.2 MTT方法检测药物对细胞的抑制率取指数生长期细胞，以1×105/ml细胞浓度接种于96孔培养板（100 μl/孔），加入无血清培养液稀释的药物10μl。实验组将ACR的PSC浓度(6μg/ml)分别与CDDP的1/10 PSC(0.3μg/ml)、PSC浓度(3μg/ml)、10×PSC浓度(30μg/ml)合用。同时设对照样品。不同药物及浓度均为3复孔。药物与细胞共同培养至24h， 每孔加<WP=5>入5mg/ml MTT 20μl。继续37°C孵育4小时后，离心吸去上清，加入200μl /孔DMSO终止反应。用酶标仪测570nm波长吸光值(A值)。计算抑制率，按金氏公式分析ACR与CDDP合用对卵巢癌细胞抑制效应。本实验重复2次。2.3 双荧光染色观察凋亡细胞将细胞与药物共同作用24h后，经1500rpm/min离心5分钟，悬浮于磷酸缓冲液中。配制吖啶橙和嗅乙啶各为0.5mg/ml 的混合染液。加荧光染液于细胞悬液内，吹打混匀、滴至载玻片上，置荧光显微镜下观察，每个样品定量计数300个细胞。按公式：凋亡细胞数 / 总细胞数×100%，计算调亡率，用按金氏公式分析实验结果。2.4 克隆抑制率检测 将细胞按1×105/ml浓度接种于培养瓶。细胞进入指数生长期后加入药物，每组均为3个实验瓶。药物与细胞共同孵育24h后，消化细胞，无血清培养液清洗。按1×103/ml细胞加入60mm2培养皿培养。连续培养7天后，0.5%结晶紫染色，镜下计数各组克隆形成数。按公式：（1-克隆形成数 / 接种细胞数）×100%，计算克隆抑制率，按金氏公式分析结果。2.5 DNA提取及电泳药物与细胞共孵育24h。离心收集细胞，加入细胞裂解液，4℃裂解20 min。经RNA酶(50μg/ml)37℃作用1h，蛋白酶K 50℃作用3h。以酚-氯仿法抽提DNA，70%乙醇洗涤后凉干。DNA沉淀溶于20μl TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA)，内含1mg/ml嗅乙啶。行1.5%琼脂糖凝胶电泳。紫外透射仪观察、记录。2.6 蛋白印迹分析topoⅡ表达收集各组细胞经磷酸盐缓冲液洗涤后，加入200μl预冷细胞裂解液4℃裂解40 min。经蛋白定量后，将10μg样品加入等量上样缓冲液，经10% SDS-PAGE电泳后，用半干式电转移仪转至硝酸纤维素膜上。加入一抗，鼠抗人topoⅡ抗体4℃孵育过夜。羊抗鼠HRP标记二抗，37℃孵育1 h。二氨基联苯胺(DAB)显色后分析结果。2.7 免疫细胞化学检测泛素表达<WP=6> 药物作用后离心收集细胞、经4%多聚甲醛固定后，滴至涂有多聚左旋赖氨酸的载片上。用冷0.1M PBS (pH 7.4)冲洗。3%甲醇-过氧化氢室温孵育15 min封闭过氧化物酶。1%Triton X-100，40C过夜。冷PBS冲洗3遍，5min/次。湿盒内10%山羊血清孵育30 min，370C。滴加1:200(0.01M PBS稀释)一抗，小鼠抗人泛素单克隆抗体，于湿盒内40C孵育过夜。其后PBS清洗三次，5min/次；滴加二抗，羊抗小鼠生物素IgG(1%BSA-PBS稀释)，湿盒内370C温育30 min。PBS冲洗后，滴加1:300稀释(0.01M PBS稀释) HRP标记的亲和素，370C温育40min。滴加DAB显色。苏木精复染，常规脱水、透明、封片、显微镜下观察记录。结 果1 MTT检测结果应用MTT检测可见：ACR单独作用后对卵巢癌抑制率为12.5±1.2%，CDDP单独用药依据作用浓度的不同，0.3μg/ml浓度下抑制率为6.20±3.2%；3μg/ml为23.5±1.2%，30μg/ml为56.3±2.2%，而与ACR共同作用后，其抑制率分别提高为18.5±4.3%、35.7±5.1%、78.2±4.0。以上结果用金氏公式分析两药的合并效应，结果表明，ACR与CDDP具有明显的协同效应。2 双荧光染色观察细胞凋亡将药物与细胞共同作用后，经吖啶橙、嗅乙啶双荧光染色观察可见：正常细胞呈绿色，依据常染色质和异染色质不同，荧光密度有所差异。凋亡细胞或可见凋亡小体，中晚期凋亡细胞呈橘红色或红色、染色质凝集、染色均匀，细胞核变小。计算各组细胞凋亡率，结果表明：ACR和CDDP合用与药物单用相比，细胞凋亡率明显增加。3 药物对细胞克隆抑制率的影响为判断不同药物作用后细胞的生存能