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背景心力衰竭是多种心血管疾病发展的最终结局,有较高的发病率和死亡率,寻找有效改善心衰的疗法是一个亟待解决的难题。附子有回阳救逆之功,是中医临床治疗心衰的首选中药,但由于其极易引起心律失常等毒副反应,因而在临床上的应用受到较大限制。乌头碱既是附子的主要有效成分,亦是其主要毒性成分,因此寻找能够使乌头碱增效/减毒的方法对于保证附子疗效的同时也可以提高其用药安全具有重要意义。以往大量研究表明,心肌细胞中肌浆网的钙调控异常是心力衰竭主要的病理机制;乌头碱改善心衰的效应及其毒副反应的机制亦均与心肌细胞内钙调控密切相关;另一方面,现有大量研究资料以及本研究室前期相关研究工作显示:针刺可通过调节心肌细胞钙调控关键蛋白的表达,减轻心肌细胞内钙超载,能够增强心肌收缩力,并能够改善缺血性心律失常,对心肌有良好的保护作用。可见,心衰的发生及发展、乌头碱药理毒理机制、针刺改善心功能效应三者均离不开心肌细胞内钙的调控机制。有鉴于临床上电针配合常规心衰治疗药物可达到加强疗效、优势互补的效果,以及综合本研究室以往有关电针对洋地黄类药物增效/减毒效应及机制的研究结果,我们的设想是,电针与乌头碱联合应用可以更有效地改善心衰,且细胞内钙调控有关的关键因子可能参与介导了穴位电针对乌头碱的增效/减毒机制。目的以心肌细胞内钙调机制为切入点,分析心衰病理机制、乌头碱药理毒理及针刺效应与心肌细胞钙调机制之间的关系,在确定电针联合乌头碱对心力衰竭模型大鼠具有改善心肌功能、减少毒副作用的基础上,从心肌细胞内钙调控相关蛋白表达的角度,进一步分析探讨电针与乌头碱合用改善心衰增效/减毒效应的科学机制,以期为非药物疗法的电针与乌头碱联合改善心衰开辟一条有效安全的新途径,同时为针药结合应用于其他疾病的治疗提供科学佐证。方法本实验采用股静脉持续输注盐酸普萘洛尔溶液制备大鼠急性心力衰竭模型,并以左心室内压最大上升速率下降至低于正常值(baseline)的60%作为急性心力衰竭造模成功的标准。实验采用体重为280±30g的健康雄性SD大鼠54只,随机分为正常对照组(Normal control group,NC),模型组(Model group,M),电针组(Electroacupuncture group,EA),乌头碱(Aconitine group,ACO)低(5μg/kg)、中(10μg/kg)、高(20μg/kg)剂量组(ACO5、ACO10、ACO20),乌头碱低、中、高剂量加电针组(ACO5+EA、ACO10+EA、ACO20+EA),每组6只。NC组不给药、不电针,仅推注同体积生理盐水;其他各组均接受盐酸普萘洛尔制备急性心衰模型。M组造模成功后不给电针,仅经股静脉推注生理盐水;单独静脉注射乌头碱各组造模成功后不电针,仅向股静脉推注相应浓度的乌头碱生理盐水溶液。EA组以及电针联合乌头碱各组于造模成功后给予大鼠双侧内关穴电针刺激30min(电针参数:强度3mA,频率2/15 Hz),电针联合乌头碱各组在电针开始的同时立即向股静脉推注生理盐水或相应浓度的乌头碱生理盐水溶液。本研究分为以下两部分进行:第一部分实验主要观察确定电针与乌头碱合用对急性心衰大鼠的增效/减毒作用。通过经颈动脉插管技术检测左心室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、心率(Heart rate,HR)、左心室内压最大上升/下降速率(Maximal rate for left ventricular pressure rising and declining,±dp/dtmax)等血流动力学指标,并采用小动物超声影像技术检测左心室射血分数(Left ventricular ejection fraction,LVEF)、左心室短轴缩短率(Left ventricular fractional shortening,LVFS)等心功能指标评价电针与乌头碱联合应用改善心衰的增效作用,另一方面,通过心电图变化分析心律失常类型并进行评分,以确定电针对乌头碱的减毒作用。第二部分实验主要探讨电针联合乌头碱改善心衰的钙调机制。采用荧光免疫印迹法(Fluorescent Western Blotting)分别检测各组大鼠左心室心肌组织中Ca2+ATP 酶(Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase,SERCA2a)、磷酸受纳蛋白(Phospholamban,PLB)、钠钙交换体(Na+-Ca2+exchange,NCX)蛋白的表达;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清中肌钙蛋白T(Troponin T,cTnT)含量,探讨电针是否通过影响心肌细胞内钙调机制的关键蛋白,从而介导了对乌头碱改善心衰的增效/减毒作用。结果1电针联合乌头碱改善心衰增效/减毒作用的观察确定1.1乌头碱最佳剂量的筛选1.1.1血流动力学指标变化NC 组大鼠 LVSP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEF 和 LVFS 均处于较高水平,并且在整个实验过程中保持相对平稳。M组大鼠前述血流动力学指标在造模成功后各时间点与NC组比较均维持相对较低的水平(P均<0.01)。ACO5组心衰大鼠的+dp/dtmax与M组+dp/dtmax比较略有提升;ACO5+EA组心衰大鼠的LVSP、+dp/dtmax较 M 组 LVSP、+dp/dtmax有显著提高(P<0.05 或 P<0.01);ACO10组心衰大鼠+dp/dtmax与M组+dp/dtmax比较明显升高(P<0.01),且有提高心衰大鼠LVSP的趋势;ACO10+EA组大鼠能进一步提高心衰大鼠的HR、-dp/dtmax,与ACO10组具有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。ACO20组心衰大鼠+dp/dtmax与M组比较+dp/dtmax有明显提升(P<0.01),且有提高心衰大鼠LVSP的趋势,而HR、-dp/dtmax明显下降与M组水平相当(P>0.05)。ACO20+EA组心衰大鼠LVSP、+dp/dtmax与M组LVSP、+dp/dtmax比较有明显提升(P<0.01)。不同干预各组LVEF和LVFS与M组比较均明显升高(P<0.05或P<0.01),其中以ACO10+EA组和ACO20+EA组大鼠对LVEF和LVFS提升更为显著,与NC组相应水平相当(P均>0.05)。1.1.2心律失常评分变化大鼠静脉给药后60min内,单独给药各组均出现了不同程度的心律失常,其中以ACO20组最为明显,同组大鼠100%的出现了较为频发的室性期前收缩,其心律失常评分明显高于ACO5组和ACO10组的心律失常评分(P<0.05或P<0.01);而乌头碱联合电针各组心率失常发生率及评分均有不同程度地减低,其中ACO10+EA组减低的较为明显,其心律失常评分亦均明显低于ACO10组、ACO20组以及ACO20+EA组(P均<0.01)。另外,虽然ACO20+EA组大鼠心律失常发生率和评分与ACO20组相比虽有所下降,但是其心律失常评分与ACO20组比较并无统计学差异(P>0.05),在电针及给药后60min内,ACO20+EA组大鼠仍出现了较为频发的室性期前收缩。综合上述研究结果,我们将电针联合静脉注射10μg/kg乌头碱作为主要的干预方式,进一步观察电针联合乌头碱改善心衰大鼠的效应及其相关的钙调机制。1.2电针联合乌头碱改善急性心衰大鼠增效/减毒作用的观察确定1.2.1血流动力学指标变化NC组大鼠 LVSP、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEF 和 LVFS 均处于较高水平,并且在整个实验过程中保持相对平稳。M组大鼠前述血流动力学指标在造模成功后各时间点与NC组比较均维持相对较低的水平(P均<0.01)。单用电针即刻就可以显著升高心衰大鼠的+dp/dtmax(P<0.01),但随后有逐渐回落的趋势,单用乌头碱及电针与乌头碱合用的治疗方式均可以显著升高心衰大鼠的+dp/dtmax,其中 ACO10+EA 组还可以明显提升 LVSP、-dp/dtmax(P<0.05 或P<0.01),且在相应时间点亦明显高于EA组和ACO10组(P<0.05或P<0.01),并有提高心衰大鼠HR的趋势。另一方面,不同干预方式各组大鼠LVEF、LVFS均有不同程度的提高,均明显高于M组相应数据(P均<0.01),其中以电针与乌头碱合用组大鼠LVEF、LVFS提升的最为明显,明显高于单给电针组(P<0.05或P<0.01),并有高于单用乌头碱组的趋势。1.2.2心律失常评分变化单用乌头碱组大鼠全部发生了不同程度的心律失常,心律失常评分亦较高,而乌头碱与电针合用后,大鼠心律失常发生率显著降低且程度减轻,其心律失常评分亦明显减低。前述结果表明,电针明显的即时效应联合静脉注射乌头碱的快速持续效应可以显著改善急性心衰大鼠的心肌收缩及舒张功能,且相比较单用电针和单用乌头碱的方式而言,确实具有起效快以及药物作用时间窗宽等优点,且电针在增强乌头碱改善急性心衰大鼠心肌舒缩功能的基础上,还可以明显抑制乌头碱导致的心律失常毒副反应,亦具有一定程度的减毒作用。2.电针联合乌头碱改善心衰的钙调机制研究2.1 SERCA2a是否参与介导电针对乌头碱改善心衰增效/减毒作用的研究NC组大鼠心肌组织中SERCA2a蛋白相对表达量较高,而M组SERCA2a蛋白表达量与NC组比较显著降低(P<0.01);EA组SERCA2a蛋白表达量与M组比较明显增加(P<0.05);ACO10组SERCA2a蛋白表达量虽有升高的趋势,但与M组相比并未见明显差异(P>0.05);ACO10+EA组SERCA2a蛋白表达水平最高,与M组比较有明显增加(P<0.05),且亦明显高于EA组和ACO10组SERCA2a蛋白水平(P<0.05和P<0.01)。2.2 PLB是否参与介导电针对乌头碱改善心衰增效/减毒作用的研究NC组大鼠心肌组织中PLB表达相对较低,而M组PLB表达量与NC组比较显著升高(P<0.01);EA组、ACO10组、ACO10+EA组PLB表达与M组比较明显减低(P<0.05或P<0.01)。其中以ACO10+EA组PLB含量最低,其与EA组和ACO10组PLB表达量比较亦均有明显减低(P均<0.05)。2.3 NCX1是否参与介导电针对乌头碱改善心衰增效/减毒作用的研究NC组大鼠心肌组织中NCX1蛋白表达量相对较低,而M组NCX1蛋白表达量与NC组比较有显著升高(P<0.01),ACO10组NCX1蛋白表达与NC组比较仍处于较高水平(P<0.01);而EA组和ACO10+EA组的NCX1蛋白表达量较M组显著下调(P<0.01)。2.4 cTnT是否参与介导电针对乌头碱改善心衰增效/减毒作用的研究NC组大鼠血清中cTnT浓度较低,而M组cTnT浓度与NC组比较明显升高(P<0.01),EA组和ACO10+EA组cTnT含量与M组比较均有明显降低(P<0.05和P<0.01),而ACO10组cTnT含量仍处于较高水平,与M组比较并无明显变化(P>0.05),且明显高于EA组和ACO10+EA组(P<0.05或P<0.01)。结论1.急性心衰大鼠心肌细胞中SERCA2a蛋白表达明显减低,PLB蛋白和NCX1蛋白的表达则显著升高,此外,其外周血中肌钙蛋白cTnT的浓度也异常升高,心肌细胞内钙调机制的紊乱是心衰进程中心肌收缩力减弱的重要因素。2.乌头碱的强心作用和致心律失常副作用的产生可能均与下调心肌组织中的PLB表达以及增加NCX1的表达有关。3.电针在增强乌头碱改善急性心衰大鼠心肌舒缩功能的基础上,还可以明显抑制乌头碱导致的心律失常毒副反应,亦具有一定程度的减毒作用。4.心肌细胞中的SERCA2a、PLB和NCX1蛋白以及外周循环中的cTnT等钙调关键蛋白均可能参与介导了电针和电针联合乌头碱改善心衰的保护作用;并且,电针可能是通过提高心肌组织中SERCA2a蛋白含量、下调心肌组织中PLB和NCX1蛋白表达以及减少外周循环中cTnT含量来实现对乌头碱改善心衰的增效/减毒作用。