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猪丁型冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus,PDCoV）是一种新型猪肠道冠状病毒,能够引起哺乳仔猪腹泻、呕吐和脱水,是目前造成新生仔猪死亡的重要原因之一。该传染性疾病自2011年香港首次发现以来,陆续在美国,韩国和中国等国家地区出现,给各国养殖业带来了巨大隐患。本研究开展了四川PDCoV毒株的S全基因克隆与生物信息学分析,根据生物信息学分析结果,选择扩增了含S基因主要抗原表位区域（S1基因C末端结构域（C terminal domain,CTD）,命名为S1-CTD）的基因片段并构建了原核表达载体pET28a-S1-CTD,表达获得S1-CTD重组蛋白并建立了检测PDCoV抗体的间接ELISA方法。1.四川PDCoV S基因的克隆与生物信息学分析参考PDCoV S基因序列（Genbank:KY436218）设计两对特异性引物,分段扩增2株PDCoV的完整S基因,分别将其克隆至pBM16A-TOPO载体,获得重组克隆质粒pBM16A-NC05S1、pBM16A-NC07S1、pBM16A-NC05S2、pBM16A-NC07S2。重组克隆质粒经测序所得基因序列运用生物信息学软件分析;同源性分析显示本研究克隆S基因与实验室此前克隆CHN-SC2015毒株S基因同源性在99.3%-99.6%之间,国内分离株的同源性明显高于国外分离株;进化树分析显示本实验室克隆毒株与中国地区报道的毒株进化距离较近,与四川地区Sichuan S27毒株进化距离最近,而与韩国、美国、东南亚地区流行毒株进化距离较远;二级结构分析,S蛋白主要以α螺旋和β折叠为主,其次是无规则卷曲,最少为β转角,四种结构交替出现;通过亲疏水性分析和跨膜区预测,S蛋白为亲水性蛋白,在19aa-20aa位置存在一个信号肽,N端S1区位于膜内侧,C端S2区位于膜外侧;B细胞抗原位点预测结果显示,S1区域包含S蛋白主要的B细胞抗原表位。2.PDCoV S1-CTD基因的原核表达及多克隆抗体的制备根据S基因生物信息学分析结果,本研究设计一对特异性引物扩增了S基因主要抗原表位区域S1-CTD,构建重组表达载体pET28a-S1-CTD。对重组载体进行双酶切鉴定和测序鉴定后转化表达宿主菌BL21（DE3）,阳性宿主菌经IPTG诱导、超声破碎、Ni+柱纯化,得到大小为41kDa,且主要以包涵体形式存在的目的蛋白。包涵体蛋白在透析复性后免疫家兔制备多克隆抗体,间接ELISA方法检测多抗效价,Western-blot和间接免疫荧光检测多抗特异性。结果表明目的蛋白获得了正确表达复性,且制备的多克隆抗体具有良好的生物活性。为下一步ELISA诊断方法的建立奠定基础。3.基于S1-CTD蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用以纯化复性的S1-CTD重组蛋白为基础,建立了检测PDCoV抗体的ELISA方法。经本方法筛选确定,抗原最佳包被浓度为1μg/孔,血清最佳稀释度为1:50,酶标二抗最佳稀释度为1:5000,封闭时间、二抗反应时间和显色时间也做了相应优化;通过对40份PDCoV阴性血清的间接ELISA结果进行统计学分析,确定本方法的判定标准为:当OD450≥0.377时判为阳性,当OD450<0.309时判为阴性,介于两者之间为可疑;在重复性试验中,变异系数均小于10%;使用本研究建立的间接ELISA方法检测CSFV、PRRSV、PCV、PRV、JEV、PoRV、PEDV、TGEV的标准阳性血清,结果均为阴性;对比病毒中和试验检测方法,本方法检测样品的总符合率达83.3%;最后,用所建立的ELISA方法对2018年收集自四川地区的231份1月龄猪临床血清进行检测,PDCoV的阳性率为2.59%。