马立克氏病(MD)是一种由马立克氏病病毒(Marek’s Diseas Virus,MDV)感染禽类引起的具有高度细胞结合特性的传染性肿瘤病,马立克氏病病毒(MDV)是一种致T细胞瘤的疱疹病毒,然而病毒的致肿瘤机制仍不十分清楚。所有致肿瘤的MDV均属于血清I型,而与I型MDV致肿瘤相关的3个基因:132-bPr、pp38、meq基因中,pp38基因编码的38 000磷蛋白(pp38)在肿瘤和细胞系中的表达存在差异,而I型特异性的pp38复合体是迄今为止在MDV诱发的肿瘤及非生产性肿瘤细胞系中唯一能检出的MDV特异性抗原,pp38则被证实可抑制机体的免疫应答。CVI988株属于MDVI型疫苗株,RB1B株属于MDV I型强毒株。本研究通过PCR法,从感染MDV强毒株RBIB与疫苗株CVI988的CEF细胞总RNA中扩增pp38基因序列。实验结果表明,疫苗株与强毒株均可扩增出约870bp的pp38基因片段。序列分析比对结果显示,除了在第107和109位氨基酸发生变异外,其余部分完全相同。为了进一步了解pp38在细胞感染MDV后免疫应答中的作用机理,将扩增出的基因片段用限制性内切酶HindⅢ、XhoⅠ酶切消化,然后插入经HindⅢ及XhoⅠ酶切好的真核表达载体pCMV-C-Flag中,经酶切鉴后构建成pCMV-pp38-Flag质粒。构建的表达质粒转染CEF细胞,通过间接免疫荧光试验(IFA)和western-blot实验验证pp38磷蛋白的表达。真核表达载体pCMV-CVI988-pp38和pCMV-RBlB-pp38的正确构建为进一步研究MDV I型强毒株与致弱株间pp38基因对宿主细胞免疫应答抑制机理的差异提供了试验材料。为研究马立克氏病病毒pp38蛋白对宿主细胞天然免疫的影响,本研究将构建的真核表达载体 pCMV-CVI988-pp38 和 pCMV-RBlB-pp38 转染至 CEF 细胞中,经 poly(I:C)刺激,分别在6,12,24小时收集细胞RNA,利用荧光定量的方法检测各个采样时间点TLR基因家族,包括TLR3、TLR7、TLR15、TLR21和TLR2、TLR4,以及TLR3信号通路相关基因的相对表达量。结果表明pp38对TLR3-TRIF通路有一定的抑制作用,并影响通路下游炎性因子的表达,且不同致病力的毒株pp38在分子水平的差异明显。同时也检测了MyD88通路下游基因IRAK4、TRAF6、IFNA、IFNB等基因以及其他一些细胞因子的相对表达水平。实验结果显示pp38对这些因子表达量的影响与MDV的毒力有关。本研究发现MDV疫苗株与强毒株pp38蛋白对TLR3-TIRF途径有抑制作用,且这种抑制作用在不同毒株之间均存在,而pp38对TLR2、7、15以及一些下游细胞因子表达量的影响与毒力有关。这些结果为研究不同MDV毒株的pp38蛋白在体内外对细胞天然免疫的反应提供了依据,也为研究pp38免疫抑制作用在不同毒力的毒株间的差异性奠定了基础,将更有利于全面了解pp38在MDV致肿瘤中的作用机制。