引言:肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤微环境中抑制性免疫细胞的主要组成,不仅抑制机体的抗肿瘤免疫,而且促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移,以及瘤体内血管新生和上皮-间质转换等。已报道,肿瘤微环境中多种因素可调控TAM的形成（如:CSF-1、TGF-β、IL-10等细胞因子,CCL2、CCL5等趋化因子,PGE2,乳酸等代谢产物和外泌体等）,然而,TAM的形成机制尚不完全清楚,有待进一步研究。本课题组前期研究证实,肿瘤细胞释放自噬小体（tumor cell released autophagosome,TRAP）可携带损伤相关分子模式（damage associated molecular pattern,DAMP）分子,通过HMGB1-TLR2-MyD88-NF-κB信号通路诱导B细胞成为具有免疫抑制功能的IL-10⁺调节性B细胞（regulatory B cell,Breg）;另外,通过大胞饮方式吞噬TRAP的人中性粒细胞可产生活性氧（reactive oxygen species,ROS）,后者进一步活化Caspase-3诱导中性粒细胞凋亡,并依赖细胞间直接接触方式抑制T细胞的增殖和IFN-γ产生,因此,TRAP能否调控巨噬细胞的极化及其免疫调节功能,值得深入研究。目的:探讨TRAP对巨噬细胞极化的调控作用及其分子机制;研究TRAP诱导巨噬细胞对T细胞应答及其抗肿瘤作用的调节作用及其分子机制。方法:1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）调控巨噬细胞极化及其机制的研究1.1 TRAP调控巨噬细胞极化的研究用CFSE和PE-F4/80分别标记TRAP和骨髓来源的巨噬细胞（bone marrow derived macrophage,BMDM）,0.5 h后用激光共聚焦显微镜观察BMDM对TRAP的摄取;分别用TRAP、LPS+IFN-γ和IL-4刺激BMDM,48 h后收获细胞及上清,流式细胞术检测CD86、MHC II和CD206的表达,荧光定量PCR检测一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS2）和精氨酸酶1（arginase 1,Arg1）基因mRNA表达水平,ELISA检测上清中IL-1β、IL-6、IL-10和IL-12p70的含量。TRAP刺激BMDM 48 h,流式细胞术检测PD-L1、PD-L2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、TIM-4和VISTA的表达。BMDM与不同浓度TRAP共孵育48 h,或与不同肿瘤细胞株来源TRAP共孵育48 h,检测PD-L1和IL-10的表达水平。不同剂量TRAP经腹腔注射小鼠,3天后取腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测CD206⁺和PD-L1⁺巨噬细胞的比例,荧光定量PCR检测IL-10和Arg1基因mRNA表达水平。1.2 TRAP调控巨噬细胞极化的分子机制研究用TRAP分别刺激WT、TLR2^-/-、TLR4^-/-和MyD88^-/-小鼠BMDM,48 h后收获细胞及上清,流式细胞术检测检测PD-L1的表达,ELISA检测上清中IL-10的浓度。将TRAP与WT小鼠BMDM孵育不同时间,Western blot检测p38和Stat3的磷酸化水平。用p38抑制剂SB203580预处理巨噬细胞2 h,然后加入TRAP刺激2 h,Western blot检测Stat3的磷酸化水平。分别用不同浓度的p38抑制剂SB203580和Stat3抑制剂Stattic预处理巨噬细胞2 h,再与TRAP共孵育48 h,收集细胞和上清,检测PD-L1和IL-10的表达。分别用蛋白酶K、DNase I和RNase A处理TRAP,再刺激BMDM,48 h后收获细胞及上清,检测PD-L1和IL-10的表达。分别用αHMGB1、αHSP60、αHSP70、αHSP90α和αHistones单抗以及同型对照IgG抗体预处理TRAP,再刺激BMDM,48 h后收集细胞及上清,检测PD-L1和IL-10的表达。2.TRAP诱导巨噬细胞免疫调节功能的研究2.1 TRAP诱导巨噬细胞调节T细胞应答及其机制的研究分选小鼠CD4⁺T和CD8⁺T细胞,CFSE标记后加入抗CD3单抗包被的孔板中,同时加入可溶性抗CD28单抗体外刺激T细胞增殖,3 h后,加入不同比例TRAP诱导的巨噬细胞或用Transwell小室隔离TRAP诱导巨噬细胞,72 h后流式细胞术检测T细胞增殖比例。分离OT-I小鼠脾脏细胞并用CFSE标记,加入OVA_257-264多肽刺激T细胞增殖,3 h后,加入OVA⁺或OVA^-TRAP诱导巨噬细胞,60 h后流式细胞术检测T细胞增殖比例。分离OT-I小鼠脾脏细胞并用CFSE标记,加入OVA_257-264多肽刺激T细胞增殖,3 h后,加入TRAP诱导的WT、TLR2^-/-、TLR4^-/-和MyD88^-/-小鼠BMDM,60 h后流式细胞术检测T细胞的增殖情况。将TRAP诱导的巨噬细胞加入抗CD3/CD28单抗刺激的T细胞增殖体系中,分别加入αPD-L1单抗,αIL-10单抗,或者αPD-L1+αIL-10单抗,72 h后流式细胞术检测T细胞增殖情况。2.2 TRAP诱导巨噬细胞调节荷瘤小鼠肿瘤生长及其机制的研究将未刺激或经TRAP刺激的野生型或PD-L1^-/-巨噬细胞与B16F10细胞以1:2混合后建立小鼠皮下荷瘤模型,定期测量肿瘤大小,比较各组肿瘤生长情况。实验分组如下:（1）B16F10;（2）B16F10+WT-M?;（3）B16F10+WT-M?（TRAP）;（4）B16F10+PD-L1^-/--M?;（5）B16F10+PD-L1^-/--M?（TRAP）。2.3荷瘤小鼠内源性TRAP对TAM表型及T细胞抗肿瘤免疫应答的调节作用研究建立Beclin1-KD-B16F10和Ctrl-B16F10小鼠皮下荷瘤模型,观察肿瘤生长情况,待肿瘤生长至约100 mm²时处死小鼠。制备肿瘤组织单细胞悬液,检测CD206、PD-L1、CD86和MHC II在TAM中的表达情况。分离小鼠脾脏细胞和引流淋巴结（draining lymph nodes,dLNs）细胞并用灭活的B16F10细胞再刺激21 h,富集肿瘤浸润淋巴细胞（tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）并用PMA和Ionomycin刺激5 h,胞内染色法检测IFN-γ⁺CD4⁺T、IFN-γ⁺CD8⁺T及Ki-67⁺CD4⁺T、Ki-67⁺CD8⁺T细胞的比例。3.癌症患者胸/腹水来源自噬小体诱导单核细胞极化及其免疫调节功能的研究从25例癌症患者胸/腹水中提取TRAP,ELISA检测胸/腹水中IL-10的含量,流式细胞术检测CD14⁺单核细胞PD-L1的表达,运用Spearman方法分析TRAP水平与PD-L1、IL-10表达之间的相关性。流式细胞术检测癌症患者、健康人外周血中LC3B⁺自噬小体的比例和CD14⁺单核细胞PD-L1、CD163及IL-10的表达。分离健康人外周血CD14⁺单核细胞,并与10例癌症患者胸/腹水来源TRAP共孵育,72 h后收获细胞和上清,流式细胞术检测HLA-DR、CD86、CD163和PD-L1的表达,ELISA检测上清中IL-10的含量。使用微磁珠从1例肺癌患者腹水提取物中分离高纯度的LC3B⁺细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）和LC3B^-EVs,分别刺激健康人纯化的CD14⁺单核细胞,72 h后收获细胞和上清,流式细胞术检测HLA-DR、CD86、CD163和PD-L1的表达水平,ELISA检测上清中IL-10的含量。分离健康人T细胞并用CFSE标记,放入预包被抗人CD3单抗的孔板中,并加入胸/腹水来源TRAP刺激的单核细胞或用Transwell小室共培养,5天后流式细胞术检测T细胞的增殖比例。将健康人T细胞放入预包被抗人CD3单抗的孔板中,并加入未刺激单核细胞（M0）、MDA-MB-231来源TRAP刺激的单核细胞（M0/c-TRAP）和肺癌患者腹水TRAP刺激的单核细胞（M0/p-TRAP）,24 h后收集细胞和上清,流式细胞术检测CD25⁺CD4⁺T、CD25⁺CD8⁺T及IFN-γ⁺CD4⁺T、IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例。结果:1.肿瘤细胞释放自噬小体（TRAP）调控巨噬细胞极化及其机制的研究1.1 TRAP调控巨噬细胞极化的研究体外实验显示:巨噬细胞体外能快速摄取大量TRAP,TRAP可刺激巨噬细胞上调表达CD206,轻微下调表达MHC II,而对CD86的表达没有影响。值得关注的是,TRAP能诱导巨噬细胞上调表达PD-L1分子,但对其它PD-L2、B7-H2、B7-H3、B7-H4、TIM-4和VISTA等6种负性膜分子的表达没有影响。同时发现:TRAP能诱导巨噬细胞上调Arg1的转录水平、分泌IL-10、IL-6和IL-1β,IL-12p70未见明显变化。B16F10、EL4、Hepa1-6和4T1细胞来源TRAP都能刺激BMDM上调表达PD-L1和IL-10。体内实验发现:TRAP可诱导小鼠腹腔巨噬细胞表达更高的CD206、PD-L1、IL-10和Arg1。提示:TRAP可诱导PD-L1^hiIL-10⁺巨噬细胞的形成。1.2 TRAP调控巨噬细胞极化的分子机制研究TRAP可显著诱导WT及TLR2^-/-巨噬细胞上调PD-L1,与WT相比,TRAP诱导TLR4^-/-巨噬细胞上调PD-L1的能力显著下降,TRAP几乎不能上调MyD88^-/-巨噬细胞PD-L1的表达。TRAP诱导TLR2^-/-巨噬细胞分泌IL-10的水平低于WT组,与TLR2^-/-相比,TRAP诱导TLR4^-/-巨噬细胞分泌IL-10的水平进一步下降,TRAP不能刺激MyD88^-/-巨噬细胞分泌IL-10。Western blot结果显示,p38在30 min时即可发生显著的磷酸化,1 h时磷酸化水平开始下降。Stat3在2 h时发生磷酸化,4 h时磷酸化水平达到最高值,8 h时开始下降。p38抑制剂能显著抑制TRAP对巨噬细胞Stat3的活化。SB203580和Stattic都可显著抑制巨噬细胞PD-L1和IL-10的表达。蛋白酶K处理后的TRAP刺激巨噬细胞上调PD-L1和IL-10表达的能力显著降低,而DNase和RNase处理并不影响TRAP的活性。封闭TRAP中的HMGB1、HSP60、HSP70、HSP90α或Histones并不影响TRAP诱导巨噬细胞PD-L1的表达。提示:TRAP所含蛋白质组分诱导巨噬细胞极化依赖TLR4-MyD88-p38-Stat3信号通路。2.TRAP诱导巨噬细胞的免疫调节功能及其机制的研究2.1 TRAP诱导巨噬细胞调节T细胞应答及其机制的研究T细胞增殖实验发现:与未刺激巨噬细胞相比,TRAP诱导巨噬细胞可显著抑制αCD3/αCD28单抗刺激的CD4⁺T和CD8⁺T细胞增殖,Transwell小室隔离TRAP诱导巨噬细胞可大部分恢复CD4⁺T和CD8⁺T细胞的增殖活性。OVA⁺和OVA^-TRAP诱导巨噬细胞均可抑制OT-I小鼠CD8⁺T细胞增殖。提示:TRAP诱导巨噬细胞以抗原非特异性方式抑制T细胞增殖,且依赖细胞间的直接接触。另外,WT M?/TRAP与TLR2^-/-M?/TRAP皆可显著抑制CD8⁺T细胞增殖,TLR4^-/-M?/TRAP对CD8⁺T细胞增殖的抑制作用显著下降,MyD88^-/-M?/TRAP不能抑制CD8⁺T细胞增殖。提示:TLR4-MyD88信号通路,而非TLR2,在TRAP诱导抑制性巨噬细胞中发挥主要作用。抗体封闭实验显示:与TRAP诱导巨噬细胞组相比,αPD-L1单抗可显著升高CD4⁺T和CD8⁺T细胞的增殖比例,αIL-10抗体可小幅度升高CD4⁺T和CD8⁺T细胞的增殖比例,同时加入αIL-10和αPD-L1两种抗体后,CD4⁺T和CD8⁺T细胞的增殖比例几乎恢复至未刺激巨噬细胞组T细胞的增殖水平。提示:TRAP诱导巨噬细胞主要依赖PD-L1抑制T细胞增殖,IL-10仅仅发挥辅助作用。2.2 TRAP诱导巨噬细胞调节荷瘤小鼠肿瘤生长及其机制的研究肿瘤生长曲线显示,与未诱导巨噬细胞相比,TRAP诱导巨噬细胞能显著促进肿瘤的生长;PD-L1^-/--M?一定程度上减缓了肿瘤的生长,而TRAP处理与否对PD-L1^-/--M?对肿瘤生长的抑制作用没有显著影响;与WT-M?（TRAP）组相比,PD-L1^-/--M?（TRAP）组肿瘤生长速度明显减慢,甚至显著慢于单独B16F10细胞组。2.3荷瘤小鼠内源性TRAP对TAM表型及T细胞抗肿瘤免疫应答的调节作用研究相比于Ctrl-B16F10组,来源于Beclin1-KD-B16F10荷瘤小鼠组的TAM表达更低水平的CD206和PD-L1,而表达较高水平的CD86和MHC II。与Ctrl-B16F10组相比,Beclin1-KD-B16F10组脾细胞中IFN-γ⁺CD4⁺T和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例显著升高,而Ki-67⁺CD4⁺T和Ki-67⁺CD8⁺T细胞的比例无显著差异;与Ctrl-B16F10组相比,Beclin1-KD-B16F10组淋巴结细胞中IFN-γ⁺CD4⁺T和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例显著升高,Ki-67⁺CD4⁺T和Ki-67⁺CD8⁺T细胞的比例同样显著升高;与Ctrl-B16F10组相比,Beclin1-KD-B16F10组TIL中IFN-γ⁺CD4⁺T和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例显著升高,Ki-67⁺CD4⁺T和Ki-67⁺CD8⁺T细胞的比例同样显著升高。3.癌症患者胸/腹水来源自噬小体诱导单核细胞极化及其免疫调节功能的研究胸/腹水中CD14⁺单核细胞PD-L1的MFI值、胸/腹水中IL-10的浓度与自噬小体的浓度呈显著正相关。外周血中含有自噬小体,且与健康人相比,癌症患者含有更高比例的LC3B⁺自噬小体,且CD14⁺单核细胞表达更高的CD163和PD-L1。大多胸/腹水来源TRAP可刺激单核细胞下调HLA-DR,上调CD163和PD-L1,而不影响CD86的表达,且能产生高水平的IL-10。与LC3B^-EVs相比,LC3B⁺EVs上调CD163、PD-L1和IL-10以及抑制HLA-DR表达的能力更强,而二者对CD86表达的调控作用没有显著差异。与未刺激单核细胞相比,TRAP诱导单核细胞可抑制CD4⁺T和CD8⁺T细胞的增殖,而Transwell小室共培养能恢复T细胞的增殖。MDA-MB-231细胞来源TRAP诱导单核细胞（M0/c-TRAP）和癌症患者来源自噬小体诱导单核细胞（M0/p-TRAP）都能下调CD25⁺CD4⁺T、CD25⁺CD8⁺T细胞和IFN-γ⁺CD4⁺T和IFN-γ⁺CD8⁺T细胞的比例以及上清中IFN-γ的含量。结论:1.TRAP可在体外、体内活化巨噬细胞TLR4-MyD88-p38-Stat3信号通路,进而诱导PD-L1^hiIL-10⁺巨噬细胞的形成;TRAP所含蛋白质组分在调控巨噬细胞极化中发挥决定性作用,然而具体的分子仍有待深入研究;2.TRAP诱导巨噬细胞主要依赖PD-L1在体外抑制T细胞增殖和在体内促进肿瘤生长,IL-10仅仅发挥辅助作用;体内抑制TRAP的形成可下调M2-like型TAM的比例,增强抗肿瘤免疫应答,进而减缓荷瘤小鼠肿瘤的生长;3.癌症患者胸/腹水中自噬小体的水平与单核细胞PD-L1、胸/腹水中IL-10的表达呈显著正相关;癌症患者外周血中含有自噬小体,且比例显著高于健康人;胸/腹水来源TRAP可诱导表型特征为HLA-DR^loCD163^hiPD-L1^hiIL-10⁺的M2-like型单核细胞,并依赖细胞间的直接接触抑制T细胞增殖、活化和产生IFN-γ。