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背景与目的: 硫化氢(H2S),类似于一氧化氮(NO)以及一氧化碳(CO)也是被公认的气体信号分子之一,H2S在调节细胞保护信号的过程中起着重要的生理作用。目前H2S气体信号分子治疗已经被认为是最具前景的治疗策略方案,在许多生物医药中都得到有效的应用,如治疗心血管疾病,关节炎以及炎症性肠道疾病。本研究过静电纺丝方法,将H2S供体JK-1与聚己内酯(PCL)混合纺丝,得到纳米纤维结构的复合支架,并将其作为敷料应用于小鼠皮肤急性损伤模型,并通过实验来评价H2S在创面修复过程中发挥的作用。 方法: 将聚己内酯(PCL)与JK-1混合进行静电纺丝,制备PCL-JK1纳米纤维支架,其中JK1为新型的硫化氢(H2S)供体,能通过pH的改变调节H2S的释放。其次利用扫描电镜观察纤维支架表面结构,并通过亚甲蓝法来检测不同 pH情况下H2S的释放。 为了进一步检测H2S在生物体内的作用,本课题组建立以C57BL/6小鼠背部的皮肤全层切除模型,利用4%水合氯醛(0.01 ml/g)进行腹腔注射麻醉之后,对背部毛发进行清除,其次将硅胶环(外径16 mm,内径8 mm,厚度0.5 mm)缝合在背部皮肤上,然后利用6 mm直径打孔器在缝合处中心制造两个皮肤全层切除的圆形伤口。 为了证明是H2S在模型中起的作用,将动物随机分为两组,分别为PCL纳米纤维敷料组和包载JK-1的PCL纳米纤维敷料组,减少载体对实验结果的干扰作用。在创面处给予不同敷料之后,分别在0、7、14、17、20天统计创面面积大小,并计算创面愈合情况,其中创面愈合率(%)=(初始创面面积大小-不同取材日创面面积大小)/初始创面面积大小×100%。而在第7天和第20天分别对部分动物进行处死,取背部皮肤组织进行包埋切片。通过苏木精-伊红染色、马松染色来评价损伤部位肉芽组织和胶原生成情况,并通过免疫组化染色和免疫荧光染色来检测损伤组织处胱硫醚-γ裂解酶(CSE)以及血管(CD31)的形成情况。 结果: 1.首先通过扫面电镜观察,发现在PCL中混入JK-1进行纺丝之后,依旧可以保持良好的纳米纤维结构。 2.通过傅里叶红外光谱能够证明 JK-1 已经成功接入到纳米纤维支架结构中,主要表现在3320,1607以及720 cm-1处N-H和C-H的收缩弯曲振动。 3.通过亚甲蓝法来检测发现 pH=6.0 和 pH=7.4 下纳米敷料中 H2S 不同程度的释放,在pH=6.0情况下,H2S能在更短的时间内达到峰值,而在7.4 的情况下,H2S同样能在24小时达到近20μM的峰值浓度。 4.通过将细胞培养在纳米纤维敷料中,发现无论是pH=6.0还是pH=7.4,都对细胞存活没有影响。在72小时,甚至可以对细胞起到增殖的作用。说明该纳米纤维敷料在创面处也能够对促进细胞的粘附增殖。并通过H2S的标记物WSP-5检测发现敷料中所释放出的H2S能够成功进入到细胞体内。 5.通过苏木精-伊红染色,发现相较于单纯的PCL纳米纤维敷料,在其中加入JK-1能够提高损伤处肉芽组织的生成,说明JK-1所释放出的H2S能够对创面愈合起到一定的作用。 6.通过马松染色进一步发现,拥有JK-1释放H2S组的敷料能够有效提高创面修复过程中胶原的生成。 7.通过免疫组化实验发现加入H2S供体的一组,能够有效促进损伤皮肤表皮的爬行(广谱角蛋白染色),促进表皮的愈合,同时上调半胱氨酸生成酶(CSE染色)在体内的表达。 8.最后通过免疫荧光染色,发现加入JK-1的敷料组中,血小板-内皮细胞粘附分子(CD31)表达上升,说明H2S的加入能够促进损伤处血管的生成。 结论: 在PCL-JK1纳米纤维支架中,JK-1能通过降低释放速度来提高延长H2S的释放峰以及释放时间,相较于单纯的JK-1水溶液,PCL-JK1纳米纤维支架具有更好的药物缓释作用。此外,通过体外研究表明,PCL-JK1纳米纤维支架与单纯的PCL纤维支架一样,都具有良好的细胞相容性。研究最后,我们发现PCL-JK-1 纤维支架作为伤口敷料在动物皮肤创伤模型中可显著提高创面再生,其主要原因是H2S的释放,对创面起到一定的生理保护作用。