牛支原体是致牛呼吸道疾病综合征的重要病原,常在运输应激后爆发,引起牛肺炎、乳腺炎、关节炎等病症。由于缺乏特效抗生素和特异性疫苗,该病严重威胁养牛业的发展。另外,由于病原表面可变蛋白的高变性,牛支原体易产生免疫逃避,导致牛支原体病的预防和治疗变得更加困难。迄今为止,牛支原体的分子致病机制和典型的毒力因子尚不清楚,这一现象严重制约了牛支原体病的预防和治疗措施的研发。支原体可胞外生长也可胞内寄生,胞内寄生是病原逃避抗体杀伤和发挥致病作用的重要环节,而黏附是微生物内化到细胞内的关键步骤。本实验室前期经体内分离和体外连续传代至200代,分别获得了牛支原体强毒株P1及传代致弱菌株P150,并证实P150具有免疫保护作用。本论文以此为研究对象,以人源上皮细胞He La、牛源肺上皮细胞EBL、鼠源巨噬细胞RAW264.7以及牛源巨噬细胞Bo Mac细胞系为体外细胞模型,比较牛支原体强、弱菌株的黏附和侵袭以及凋亡等生物学过程的差异,并对2种牛支原体重组蛋白进行黏附和侵袭功能的深入研究,以期为揭示牛支原体强毒株的致病机理以及弱毒株的免疫保护机制提供理论依据。主要内容如下:（1）牛支原体强弱菌株与宿主细胞的黏附和侵袭研究利用微量滴定检测法以及普通菌落计数法检测牛支原体与4种细胞（He La、EBL、Bo Mac、RAW264.7）的黏附。微量滴定法发现:牛支原体强、弱菌株均可以结合包被在ELISA孔内的100μg/m L He La、EBL、RAW264.7、Bo Mac细胞蛋白,各孔OD值显著高于空白组（p<0.01）,且弱毒株P150结合细胞的能力（OD值）显著高于强毒株（p<0.01）;同时菌落计数法也证实感染比（MOI）为1000时,弱毒株P150的黏附细胞的能力显著高于强毒株P1（p<0.01）。检测P1、P115、P150和P180四个代次菌株的黏附能力,发现其黏附能力呈先升高后降低的趋势,传至180代时黏附能力显著下降（p<0.05）。此外,接种不同MOI（10,100,1000）牛支原体强、弱菌株于EBL细胞中,发现黏附能力呈剂量依赖性;细胞松弛素D和秋水仙素可显著降低P150对RAW264.7和EBL细胞的黏附,而对P1无显著性影响,说明细胞微丝蛋白聚合和微管蛋白合成对P150的黏附有重要意义,而强毒株黏附具有不同的机制。庆大霉素侵袭实验检测牛支原体强、弱菌株感染4h、8h、12h、24h后的侵袭能力,发现强、弱菌株在2种上皮细胞（He La和EBL）、3种感染比（MOI=10、100、1000）的条件下,均表现为弱毒株侵袭到胞内的菌量高于强毒株1-2个数量级,说明弱毒株的内化能力更强;激光共聚焦整合图像显示入侵胞内的P150主要附着于罗丹明鬼笔环肽标记的细胞骨架上,而强毒株P1主要聚集于细胞核周围,二者在胞内的定位不同;电镜结果发现二者均以细胞内吞途径进入胞内,通过液泡膜内陷而进入液泡。当牛支原体强、弱菌株感染EBL细胞12h后,在特定时间点进行胞内存活计数,结果发现在有抗生素的条件下,强、弱菌株均表现为持续存在,且无显著性差异;在无抗生素的条件下,随时间的推移,培养基上清中可以检测到P150菌量逐渐升高,而上清中未检测到P1;同时发现不同感染比（MOI=0.1、1、10、100、500、1000）的强、弱菌株感染后,EBL细胞活力水平均保持在100%左右,而且未有细胞凋亡现象;这些结果表明:牛支原体强、弱菌株可在胞内持续存在,均对EBL细胞无细胞毒性反应,侵袭后的P150可以从胞内逃逸,有利于其在细胞间的扩散,而强毒株一直存活在胞内,呈持续感染状态。（2）牛支原体强弱菌株差异蛋白PDHA的生物学功能分析经ELISA及Western blot证实牛支原体强、弱菌株均与血纤维蛋白溶酶原（Plasminogen,Plg）具有结合能力,利用质谱检测鉴定了与Plg结合的强、弱菌株差异蛋白,选取其中在弱毒株P150中高表达的丙酮酸脱氢酶α亚基PDHA进行深入研究。经原核表达及纯化,首先证实PDHA蛋白是一种主要定位于细胞膜上的免疫原性蛋白,可黏附4种细胞（He La、EBL、Bo Mac、RAW264.7）,其多抗血清显著抑制rPDHA与He La细胞的结合（p<0.01）;rPDHA以一种剂量依赖的方式结合胞外基质Plg,赖氨酸同源物EACA以及Na Cl盐离子可通过抑制赖氨酸以及阴离子的结合而分别抑制这种结合能力;然而PDHA抗血清与牛支原体强、弱菌株预处理后,牛支原体菌株与Plg的结合并无明显抑制;经PDHA抗血清以及Plg抗体对牛支原体强、弱菌株预处理后,牛支原体菌株与He La细胞的黏附也无明显抑制作用,但是同样的处理对菌株与EBL细胞的侵袭产生显著影响,表现为侵袭能力降低,对P150的抑制作用更为明显（p<0.01）,说明PDHA抗血清以及Plg抗体可抑制牛支原体对细胞的侵袭,但对宿主细胞的粘附抑制不明显。从实验室构建的牛支原体突变体库中,筛选PDHA突变株,其C-端缺失6个含赖氨酸残基的氨基酸,试验证实缺失株与Plg的结合能力显著下降（p<0.05）,而且与EBL细胞的黏附能力比野毒株也显著降低（p<0.01）,说明Plg是PDHA的受体蛋白,位于C-端的赖氨酸残基是该蛋白结合Plg的主要功能域之一。（3）牛支原体强弱菌株诱导巨噬细胞凋亡的分子机制抑制巨噬细胞凋亡是微生物能够在宿主体内生长繁殖而不被机体免疫系统识别清除的重要机制,因此分析牛支原体强、弱菌株诱导巨噬细胞凋亡对阐明其致病机制具有重要意义。本研究检测了鼠源和牛源巨噬细胞系（RAW264.7以及Bo Mac）对牛支原体强弱菌株的吞噬能力,发现随吞噬时间延长,巨噬细胞RAW264.7和Bo Mac均对强、弱菌株的吞噬呈升高趋势,二者无显著性差异;此外,RAW264.7经细胞松弛素D预处理后,吞噬后的菌量与未处理组相比呈显著性降低（p<0.01）,说明巨噬细胞的吞噬是一种主动摄入的过程;利用庆大霉素侵袭实验检测胞内存活,发现随着时间延长,强、弱菌株在巨噬细胞胞内的存活均呈现降低趋势,但二者并无显著差异;间接免疫荧光检测强弱菌株在RAW264.7胞内、胞外的分布,二者无明显差异,说明巨噬细胞对牛支原体强、弱菌株产生吞噬杀伤作用。利用溶酶体荧光探针与CFDA-SE荧光标记的牛支原体共定位检测发现,弱毒株P150的共定位程度明显高于强毒株,说明弱毒株更容易被溶酶体识别并降解,造成胞内活力降低。利用电镜技术进一步观察发现,强毒株大量涌进吞噬泡中,降解成一种中空的结构,而弱毒株感染后,虽然形成大量的吞噬泡,但是吞噬泡内含有的菌体较少,其余则分散于细胞质,且存在与溶酶体共定位的现象,证实强弱菌株可以被巨噬细胞吞噬后降解。MTT法检测牛支原体强、弱菌株感染巨噬细胞（RAW264.7和Bo Mac）后的细胞活力,发现随感染比的增加细胞活力逐渐降低,在感染比为500和1000的条件下,弱毒株的细胞活力显著低于强毒株（p<0.05）,随后采用感染比为1000作为诱导细胞凋亡的作用浓度。经Annexin-V/PI流式细胞仪检测,发现强、弱毒株均可诱导巨噬细胞凋亡,而且弱毒株诱导巨噬细胞的凋亡率显著高于强毒株,其中感染Bo Mac后,强毒株诱导细胞的凋亡率为43.9±2.59%,而弱毒株凋亡细胞率达93±1.77%,二者差异极显著（p<0.001）;此外,弱毒株感染后基因组断裂而暴露出的3’-OH,在TUNEL检测中呈现特异的绿色荧光,而P1组未检测到。为了进一步确定牛支原体诱导凋亡的调控机制和信号通路,利用Western blot检测了主要的膜相关受体TLR2、TLR6以及下游FADD、Caspase8、Caspase3等凋亡信号蛋白的表达量,结果表明牛支原体感染后,TLR2以及TLR6的表达升高,激活FADD启动凋亡信号通路,最终使凋亡分子Caspase 8以及Caspase 3的表达增加。比较牛支原体强弱菌株刺激Bo Mac细胞后,激活NF-κB、MAPK以及诱导炎性因子分泌的能力,发现弱毒株P150可在感染10min后激活NF-κB p65磷酸化,并抑制Iκβα的表达,强毒株P1的激活能力明显低于P150,但二者激活MAPK ERK1/2和P38的能力无明显差异,说明可能还存在其他的信号通路激活作为补偿诱导下游趋化因子和炎性因子的分泌。牛支原体感染上皮细胞EBL可分泌IL-8和RANTES等趋化因子,其中弱毒株诱导IL-8的水平显著高于强毒株,从而使其在感染巨噬细胞后,促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12m RNA表达水平显著升高,这说明弱毒株能有效招募巨噬细胞到达炎症部位,诱导的炎性反应更为剧烈,有利于机体快速清除病原。（4）牛支原体核酸酶r Mbov Nase是一种潜在的毒力因子牛支原体Mbov Nase是一种具有免疫原性的核酸酶,生物信息学预测该蛋白是一种Ca2+依赖的膜蛋白,具有一个与葡萄球菌耐热核酸酶高度同源的功能区TNASE＿3,其中219、227、272氨基酸位点为核酸酶活性位点。体外经核酸酶活性检测证实r Mbov Nase可以降解宿主细胞的DNA、RNA以及环状质粒DNA,在22℃-65℃均具有一定的核酸酶活性。将3个关键核酸酶活性位点的氨基酸分别点突变为苯丙氨酸,发现该蛋白降解DNA的能力丧失,证实219、227、272氨基酸位点为核酸酶活性位点。本研究首次发现r Mbov Nase在体外可以降解由PMA和溶血曼氏杆菌诱导的中性粒细胞胞外陷阱结构（Neutrphils extracellular traps,NETs）,推测其可通过降解NETs的DNA基质协助牛支原体逃逸NETs诱捕。免疫印迹检测发现该蛋白不仅是一种定位于牛支原体外膜的蛋白,而且是一种分泌蛋白。利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分别定性、定量的分析了r Mbov Nase蛋白对Bo Mac黏附和侵袭的影响,发现其具有一定的黏附能力,并且可以侵袭细胞入核,提示该核酸酶可能在胞外、胞膜、胞浆和核内等不同位置发挥降解核酸的作用。MTT细胞活力检测和Annexin V/PI凋亡检测发现,相比r Mbov Nase△181-342,r Mbov Nase随着自身浓度的增加,其诱导的细胞活力降低比例达10%-20%,细胞凋亡比例也呈升高趋势。进一步分析凋亡的关键信号分子,发现r Mbov Nase刺激Bo Mac 12h后,激活磷酸化NF-κb p65且抑制Iκβα表达,促凋亡蛋白Bax高表达,抑凋亡蛋白Bcl-2低表达,而Caspase 3和MAPK ERK1/2磷酸化蛋白没有发生变化。同时,缺失TNASE＿3功能区的r Mbov NaseΔ181-342不仅失去了核酸酶活性,其在胞内的其它生物学功能也受到了影响。由上述结果可以得出结论,牛支原体强、弱菌株对4种不同来源的细胞系均具有黏附和侵袭能力,对2种巨噬细胞均可诱导凋亡,其各种生物学过程在牛源细胞中表现更为明显;与强毒株相比,弱毒株具有较高的黏附和侵袭能力,推测其高表达的PDHA蛋白赋予弱毒株较强的侵袭能力;弱毒株诱导巨噬细胞的凋亡显著高于强毒株,推测其通过凋亡途径而被宿主清除,这些生物学现象可以帮助阐释牛支原体的致病机制和免疫机理。本研究还证实r Mbov Nase是一种位于膜上的、可分泌的核酸酶,不仅能够降解宿主核酸、NETs结构,而且可以黏附并侵染巨噬细胞,产生细胞凋亡,推测其可能是一种潜在的牛支原体毒力因子。