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犬急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）是一种临床多发且死亡率较高的疾病,常规疗法对病情严重患犬效果有限。干细胞疗法是近十年来新兴的一种治疗手段,以人或鼠为模型的研究显示,间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）对包括肾脏在内的多种组织的损伤展现良好的治疗效果,而MSCs治疗犬AKI的研究甚少,其治疗效果及作用机制尚不明确。为此,本文用庆大霉素处理制备犬AKI细胞模型及动物模型,并开展了以下研究:1.犬脂肪间充质干细胞（Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,AD-MSCs）及其条件培养基对庆大霉素致犬肾（Madin-Darby Canine Kidney,MDCK）细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响。本试验首先采用不同浓度（1、2、4、6及8 mmol/L）的硫酸庆大霉素处理MDCK细胞,确定最佳浓度进行后续试验。分组处理如下:（1）阴性对照组:未经庆大霉素处理的MDCK细胞;（2）模型组:经庆大霉素处理后的MDCK细胞;（3）AD-MSCs组:MDCK细胞经庆大霉素处理后,再与AD-MSCs共培养;（4）脂肪间充质干细胞条件培养基（Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells Conditioned Media,AD-MSC-CM）组:MDCK细胞经庆大霉素处理后,加入AD-MSC-CM培养。分别在24 h及48 h时通过cck-8法测定各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,以及荧光定量PCR法测定各组增殖（PCNA）及凋亡（Bcl-2和Bax）相关基因m RNA表达水平。结果显示:庆大霉素最佳作用剂量为5 mmol/L,它可显著抑制MDCK细胞的增殖及促进凋亡,而犬AD-MSCs及AD-MSC-CM均可逆转该效应。上述结果表明犬AD-MSCs及其条件培养基对庆大霉素诱导的MDCK细胞损伤有一定的修复作用。2.犬AD-MSCs对庆大霉素致犬AKI的治疗作用。试验分为造模和治疗两个阶段,6只健康中华田园犬（5～6月龄）随机分为模型组和治疗组,每组3只。造模阶段两组犬均按照80,000 IU/kg硫酸庆大霉素进行皮下注射,连续注射6 d。治疗阶段则治疗组犬在第7 d、10 d及13 d进行静脉输注2×106 cell/kg的AD-MSCs,模型组犬则静脉输注等量的生理盐水。造模及治疗效果的评估指标如下:血清肌酐及尿素氮、血清肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α）、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（Neutrophil gelatinase-associated lipocalin,NGAL）、肾损伤分子-1（Kidney injury molecule-1,KIM-1）、尿常规、解剖学观察、组织病理学观察。结果显示:与造模前对比,庆大霉素可引起犬血清肌酐及尿素氮的大幅升高,以及炎性因子TNF-α及早期肾损伤因子NGAL和KIM-1均持续升高,尿常规异常（如酸碱度下降、葡萄糖及蛋白质增加、部分出现隐血、尿比重下降等）,并且在停药后9d犬肾皮质血流量减少,镜下可见肾小管阻塞较多,肾小管上皮细胞普遍出现变性、坏死。与模型组对比,犬AD-MSCs可改善庆大霉素导致血清肌酐及尿素氮的升高,降低血清中TNF-α水平,恢复NGAL和KIM的正常水平,并在治疗9d后明显改善肾皮质血流量,减少肾小管上皮细胞损伤,维持肾小管结构完整。上述结果表明犬AD-MSCs对庆大霉素致犬AKI有一定的治疗作用。3.犬脂肪间充质干细胞外泌体（Exosome Derived from Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,AD-MSC-Exo）对庆大霉素致MDCK细胞损伤的修复作用及分子机制本试验首先采用低温超高速离心法分离AD-MSC-Exo,并对其进行鉴定。透视电镜检测犬AD-MSC-Exo呈卵圆形,粒径在30 nm～150 nm占97.45%,平均粒径62.31 nm。Western blot结果显示犬AD-MSC-Exo表达CD9、CD63和CD81表面标记。随后探究AD-MSC-Exo对受损MDCK细胞增殖、凋亡及相关基因表达的影响,实验分组及处理如下:（1）阴性对照组:未经庆大霉素处理的MDCK细胞;（2）模型组:经庆大霉素处理的MDCK细胞;（3）AD-MSC-Exo组:MDCK细胞经庆大霉素处理后,再加入100μg/m L的AD-MSC-Exo培养。cck-8法测定各组细胞增殖活力,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,以及荧光定量PCR法测定各组细胞PCNA、Bcl-2和Bax基因的m RNA表达水平。结果显示:犬AD-MSC-Exo能显著促进受损MDCK细胞的增殖,减少细胞凋亡,与犬AD-MSCs具有类似作用,提示犬AD-MSCs可通过其分泌的Exo来发挥修复作用。为确定AD-MSC-Exo发挥作用的机制,本试验对犬AD-MSC-Exo进行高通量测序,并筛选出表达量较高的cfa-mi R-99b作进一步研究。合成cfa-mi R-99b mimic、inhibitor及Negetive Control（NC）,并将上述化合物分别转染经庆大霉素处理的MDCK细胞。结果显示:与NC结果对比,cfa-mi R-99b mimic可显著促进MDCK细胞增殖,并减少细胞凋亡,而inhibitor结果相反。生物信息学方法预测cfa-mi R-99b靶基因有17个,其中涉及的主要信号通路包括增殖相关的MAPK信号通路等。上述结果提示,cfa-mi R-99b参与了AD-MSC-Exo对庆大霉素处理MDCK细胞的促增殖、抑凋亡作用,其促增殖作用可能与MAPK信号通路有关,但仍需进一步研究。