近年来,随着渔业生产集约化程度的不断提高,鱼虾的发病率不断上升,已成为制约渔业生产的因素之一。最常见的控制鱼病的方法是使用抗生素,但过度使用抗生素会有许多副作用,如影响鱼体健康和免疫功能、污染环境、在动物体中残留及产生耐药性致病菌,影响食品安全和人类健康等。因此,抗生素减量使用及抗生素替代品应用受到社会广泛关注,其中益生菌、中草药、免疫增强剂等都是潜在的、具有良好应用前景的替代品。丁酸梭菌（CB）和粪肠球菌（EF）是人和动物肠道中的有益菌,在畜牧生产中已有大量应用并显示出良好的使用效果,但在水产养殖中的研究相对有限。本文通过体内及体外试验,研究CB和EF对罗非鱼生长及健康的影响,以及可能存在的作用机制,以期为水产用―非抗‖饲料添加剂的开发提供科学依据。主要研究内容及结果如下:第一部分日粮中添加CB和EF对罗非鱼生产性能和健康状况的影响采用单因素试验,分别研究了在日粮中添加CB或EF对罗非鱼生产性能和健康状况的影响。每个试验分别选取健康,体重56.16±0.82g的罗非鱼300尾,分成5个处理,每个处理3个重复,每个重复20尾鱼。配制CB浓度分别为0、1×104、1×105、1×106和1×107CFU/g的5种日粮,分别设为CGc、CB1、CB2、CB3和CB4组;配制EF浓度分别为0、1×105、1×106、1×107和1×108CFU/g的5种日粮,分别设为CGe、EF1、EF2、EF3和EF4组。每个试验先进行56天的饲养试验,考察罗非鱼生产性能、体成分和血清理化指标。饲养试验结束后,用无乳链球菌对罗非鱼进行攻毒,评估日粮添加CB或EF对罗非鱼抗病能力的影响。结果显示:（1）CB2组末重、增重率（WGR）和特定生长率（SGR）显著高于CGc组（P<0.05）。CB对肥满度（CF）、肝体比（PHI）、脏体比（VSI）、全鱼水分（H2O）、粗蛋白（CP）、粗灰分（Ash）、血清溶菌酶（LZM）活性、血清碱性磷酸酶（ALP）活性、血清D-乳酸、血清内毒素含量没有显著性影响（P>0.05）。日粮添加CB显著降低了血清总胆固醇（TC）、丙二醛（MDA）水平、谷草转氨酶（AST）活性、二胺氧化酶（DAO）活性（P<0.05）,显著增加了血清总抗氧化能力（T-AOC）（P<0.05）。CB1和CB2组的血清谷丙转氨酶（ALT）显著低于CGc组（P<0.05）。当日粮CB浓度为1×105和1×106CFU/g时,血清葡萄糖（GLU）显著降低（P<0.05）。当日粮CB浓度为1×105、1×106和1×107CFU/g时,血清甘油三脂（TG）显著降低（P<0.05）,血清的超氧化物歧化酶（SOD）活性、血清补体3（C3）和补体4（C4）浓度显著增加（P<0.05）。当CB添加水平为1×106和1×107CFU/g时,全鱼脂肪（Fat）水平显著增加（P<0.05）。当日粮中CB添加水平为1×105、1×106和1×107CFU/g时,罗非鱼攻毒后累计死亡率（CM）显著降低（P<0.05）。（2）EF3组的末重、WGR和SGR显著高于CGe组,FCR显著低于CGe组（P<0.05）。日粮添加EF对PHI、VSI、全鱼H2O、Ash、血清T-AOC、SOD和LZM活性、内毒素含量无显著性影响（P>0.05）。EF组血清ALT活性和D-乳酸含量显著降低（P<0.05）,全鱼CP显著增加（P<0.05）。当日粮EF浓度为1×105、1×106和1×107CFU/g时,血清AST活性显著降低而ALP活性显著增加（P<0.05）。当日粮EF浓度为1×107CFU/g时,罗非鱼全鱼Fat显著增加（P<0.05）。当EF添加水平为1×106、1×107和1×108CFU/g时,血清C3和C4水平显著增加（P<0.05）。当日粮EF浓度为1×107和1×108CFU/g时,罗非鱼CF显著增加（P<0.05）,血清TC、TG和GLU显著降低（P<0.05）,血清中DAO活性显著降低（P<0.05）。当日粮EF浓度为1×108CFU/g时,血清中MDA显著下降（P<0.05）。当日粮EF添加水平为1×106、1×107和1×108CFU/g时,罗非鱼攻毒后CM显著降低（P<0.05）。结果表明:日粮添加适宜水平的CB或EF可以提高罗非鱼代谢水平,促进Fat沉积,改善肝脏和肠道健康,提高机体抗氧化能力和体液免疫功能,提高罗非鱼生长性能和疾病抵抗能力。第二部分日粮中添加CB和EF对罗非鱼肠道相关基因表达的影响试验设计和日粮同第二章。经过56天的饲养试验后,每个处理取6尾鱼,分离肠道,用实时荧光定量PCR检测肠道紧密连接蛋白（TJP）及免疫相关基因的表达。结果显示:（1）日粮添加CB显著上调了IL-1受体激酶4（IRAK-4）基因表达（P<0.05）。当日粮CB浓度为1×105、1×106和1×107CFU/g时,白细胞介素8（IL-8）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）和髓样分化因子88（My D88）基因表达被显著上调（P<0.05）。当CB添加水平为1×106和1×107CFU/g时,Toll样受体2（TLR2）基因表达被显著上调（P<0.05）。CB对白细胞介素10（IL-10）、Claudin-1和Occludin基因表达没有显著性影响（P>0.05）。TNF-α与TLR2、My D88和IRAK-4,IL-8与TLR2、My D88和IRAK-4的基因表达均呈现出显著的正相关关系（P<0.05）。（2）EF上调了Claudin-1、IL-8、TLR2、My D88和IRAK-4基因表达（P<0.05）。当EF添加水平为1×105、1×106和1×107CFU/g时,TNF-α基因表达水平被显著上调（P<0.05）。当EF添加水平为1×105和1×107CFU/g时,Occludin基因表达水平被显著上调（P<0.05）。当EF添加水平为1×107CFU/g时,IL-10的基因表达被显著上调（P<0.05）。结果表明:日粮添加适宜水平的EF上调了TJP的基因表达,从而改善了罗非鱼肠道结构和健康状况;日粮添加适宜水平的CB或EF可以上调罗非鱼肠道细胞因子IL-8、TNF-a和信号分子TLR2、My D88和IRAK-4的基因表达,激活肠道免疫,从而提高罗非鱼肠道免疫功能。第三部分日粮中添加CB和EF对罗非鱼肠道菌群的影响采用单因素试验,评估日粮添加CB或EF对罗非鱼肠道菌群的影响。选取健康,重量为78.54±0.75g的罗非鱼180尾,分成3个处理,每个处理60尾。将3个处理分成CG（对照组,饲喂基础饲料）、CB2（CB浓度1×105CFU/g）,EF3（EF浓度1×107CFU/g）,饲养试验期为56天。饲养结束后,每个处理取6尾鱼,取出后肠内容物,测定微生物组成。结果显示,罗非鱼日粮补充CB或EF后:（1）肠道微生物OUT数量增加;（2）不管在OUT水平、属水平还是门水平,肠道微生物的Sobs、Ace、Chao1和Shannon等Alpha多样性指数显著增加（P<0.05）;（3）CB2和EF3组内的肠道菌群相似性更高;（4）日粮CB和EF显著改变了罗非鱼肠道微生物组成,在检测出的49个门中,有42门的相对丰度组间差异显著（P<0.05）。与对照组相比,CB2和EF3两组的拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、Candidate-division-SR1、绿弯菌门（Chloroflexi）、绿菌门（Chlorobi）、酸杆菌门（Acidobacteria）、螺旋体门（Spirochaetae）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、Parcubacteria、浮霉菌门（Planctomycetes）和WCHB1-60的相对丰度显著增加（P<0.05）,而CKC4和梭菌门（Fusobacteria）的相对丰度显著降低（P<0.05）,变形杆菌门（Proteobacteria）在三组间差异不显著（P>0.05）。在708个属中,有368个属在组间存在显著性差异（P<0.05）。CB2和EF3两组的鲸杆菌属（Cetobacterium）、气单孢菌属（Aeromonas）和CKC4的相对丰度显著低于CG组（P<0.05）,Candidate＿division＿SR1＿norank、Bacteroidetes＿vadin HA17＿norank、脱氯单胞菌属（Dechloromonas）、冻胶菌属（Zoogloea）、Oligoflexales＿noran、Draconibacteriaceae＿uncultured、Comamonadaceae＿unclassified、Saprospiraceae＿uncultured、芽孢杆菌属（Bacillus）、硝化螺旋菌属（Nitrospira）、WCHB1-69＿norank和Parcubacteria＿norank的相对丰度显著增加（P<0.05）。结果表明:日粮添加CB或EF,可以显著改变罗非鱼肠道微生物结构和组成,增加肠道微生物多样性指数、个体相似性度和有益微生物如芽孢杆菌的相对丰度,降低条件性病原菌如气单孢菌的相对丰度,从而减少罗非鱼发病风险。第四部分CB或EF对鱼类常见病原菌的抑制作用通过体外试验,研究CB与EF对常见鱼类病原菌的抑制作用。采用平板试验法,将LB琼脂培养基溶化冷却至48-50℃,加入病原菌菌液适量迅速摇匀后倒平皿。在培养基凝固以后,将牛津杯以相等的距离安放在培养皿中,之后在牛津杯中加入等体积的无菌水、恩诺沙星、青霉素、EF培养液或CB培养液;盖上培养皿,37℃培养17h后观测透明圈直径。结果表明:CB和EF对无乳链球菌和迟缓爱德华氏菌具有显著的抑菌作用,抑菌力比青霉素弱,与恩诺沙星相当或更强。CB和EF对嗜水气单胞菌有显著的抑制作用,且抑制能力远优于青霉素。说明CB和EF对鱼类常见病原菌有一定抑制作用,有较好的―替抗‖前景。综上所述,得出以下结论:CB和EF对鱼类常见病原菌具有明显抑制作用,在日粮中适宜添加可以改善肠道微生物的结构与组成,调节肠道免疫相关基因表达,增强罗非鱼体液免疫和肠道免疫功能,提高罗非鱼生长性能和疾病抵抗力。综合生长性能、免疫和疾病抵抗力指标,罗非鱼日粮中CB和EF的添加水平分别以1×105CFU/g和1×107CFU/g为宜。