间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一种多能干细胞,因其来源广泛,自我更新、增殖能力和多向分化潜能强,并且具备免疫调节、抗炎和神经保护作用,从而成为临床细胞治疗中理想的种子细胞。移植的MSCs需定向迁移到损伤部位才能更好地发挥疗效,但有研究表明只有极少部分移植的MSCs可以到达病变部位,修复和治疗效果非常有限。因此,研究MSCs的迁移机制、提高其迁移能力对于提高MSCs的有效利用率至关重要。本文在实验室前期工作基础上,研究miR-26b靶向Rho相关丝氨酸/苏氨酸激酶(Rho-associated kinase 1,ROCK1)促进MSCs迁移的机制。本研究发现,在MSCs中转染miR-26b mimic上调miR-26b的表达能够显著降低ROCK1 m RNA水平的表达,而转染miR-26b Inhibitor(miR-26b I)抑制miR-26b后能够显著上调ROCK1 m RNA水平的表达;Western blot检测发现,高表达miR-26b后显著降低ROCK1蛋白水平的表达,而抑制miR-26b则显著提高ROCK1蛋白水平的表达,表明miR-26b负调控ROCK1的表达。进一步,我们通过查阅NCBI数据库,找到ROCK1的3’UTR序列,利用PCR获得含有miR-26b的保守结合位点的ROCK1的3’UTR,采用PCR定点突变的技术将miR-26b与ROCK1的3’UTR结合序列点突变失活,构建了大鼠ROCK1 3’UTR野生型和突变型的双荧光素酶报告基因质粒。将上述报告基因质粒与miR-26b mimic同时转入MSCs,通过酶标仪检测发现miR-26b能够显著降低野生型报告基因的表达,而对突变型报告基因的表达无影响,表明miR-26b可结合野生型3’UTR从而抑制报告基因的表达。通过上述实验我们证实在大鼠MSCs中miR-26b可直接靶向ROCK1,抑制ROCK1的表达。随后,利用Boyden chamber装置我们研究了miR-26b是否通过ROCK1影响MSCs的迁移。结果显示,转染miR-26b I抑制内源miR-26b、上调ROCK1的表达显著抑制MSCs机动性迁移和HGF诱导的趋化性迁移,若同时以ROCK1的特异性抑制剂Y27632处理,则MSCs机动性迁移和趋化性迁移能力显著提高,表明以Y27632抑制ROCK1的活性能够回复miR-26b I对MSCs迁移的抑制作用。相反,转染miR-26b mimic上调miR-26b、降低ROCK1的表达显著促进MSCs机动性迁移和趋化性迁移,若同时感染Ad-ROCK1回复ROCK1的表达,则MSCs机动性迁移和趋化性迁移能力显著下降,表明回复ROCK1的表达减弱miR-26b对MSCs迁移的促进作用。上述实验结果表明,miR-26b通过下调ROCK1的表达、抑制其活性从而促进MSCs迁移。ROCK1是Rho下游主要效应分子,有研究报道它可以通过提高肌球蛋白轻链(Myosin light chain,MLC)Ser19位点的磷酸化从而激活肌球蛋白(Myosin),导致稳定的肌动蛋白丝束的形成;ROCK1还能提高切丝蛋白(Cofilin)Ser3位点的磷酸化从而调控微丝骨架的动态性;此外,ROCK1能够激活PTEN磷酸酶活性,抑制Akt信号通路。为了研究miR-26b通过ROCK1下游哪些分子调控MSCs迁移,我们首先通过Western blot检测改变miR-26b后ROCK1下游Cofilin、MLC及Akt的磷酸化水平的变化。结果显示,上调miR-26b后Akt信号通路被激活,Cofilin和MLC的磷酸化水平都降低;而下调miR-26b后Akt信号通路则被抑制,Cofilin和MLC的磷酸化水平增加,表明高表达miR-26b能够激活Akt信号通路、降低Cofilin和MLC的磷酸化水平。进一步,我们研究miR-26b引起的上述变化是否通过ROCK1。结果显示,高表达ROCK1抑制miR-26b mimic对Akt信号通路的激活作用,回复miR-26b mimic对Cofilin和MLC磷酸化的抑制作用;使用Y27632抑制ROCK1的活性则回复miR-26b I对Akt信号通路的抑制作用,抑制miR-26b I对Cofilin和MLC磷酸化的促进作用。以上结果表明miR-26b通过ROCK1影响Cofilin和MLC磷酸化及Akt信号通路的活化。细胞极性的建立是细胞快速迁移的重要过程。有研究指出,ROCK1作为一种激酶能够改变细胞极性从而影响迁移。我们通过鬼笔环肽免疫荧光染色指示微丝,利用Image J软件统计细胞面积、周长以及长轴和短轴之比,分析细胞铺展情况和极性大小。结果发现,上调miR-26b后MSCs面积和周长都变小,并且细胞呈现出明显的极性形态。为了研究此现象是否和ROCK1有关,我们同时高表达miR-26b和ROCK1,发现同时高表达miR-26b和ROCK1后细胞面积和周长都变大,极性形态消失。上述结果表明miR-26b通过靶向ROCK1影响了MSCs的面积、周长,促进细胞极性形成。肌球蛋白是驱动细胞收缩力主要的马达分子,肌动蛋白丝(Actin filaments)和肌球蛋白相互作用形成具有收缩性的肌动球蛋白纤维(Actomyosin fibers)从而调节多种生物过程,包括胞质分裂、粘附及迁移。肌球蛋白的活化形式由轻链磷酸化产生,MLC磷酸化调控细胞在黏附、铺展及迁移过程中的形态变化。我们将高表达miR-26b的MSCs通过划痕诱导细胞向划痕区域进行定向迁移,免疫荧光染色检测MLC的磷酸化、分布及与微丝的共定位。结果发现,高表达miR-26b的MSCs中MLC的磷酸化水平降低,这与Western blot检测结果相符;p-MLC在细胞膜状突起的前缘聚集,而对照组p-MLC主要位于细胞应力纤维处,膜状突起及边缘没有分布。这些观察结果表明高表达miR-26b后会导致MSCs边缘处肌球蛋白富集。综上所述,本文的研究结果表明miR-26b通过靶向ROCK1,降低Cofilin和MLC的磷酸化、激活Akt信号通路,促进MSCs形成较小铺展面积和细胞极性的形成,促进p-MLC在迁移细胞膜状突起前缘的分布,从而促进MSCs迁移。本研究进一步阐明miR-26b调控MSCs迁移的分子机制,为MSCs的临床移植治疗提供理论基础和实验依据。