背景:胆汁淤积（cholestasis）是指肝内外各种原因造成胆汁形成、分泌和排泄障碍,胆汁流不能正常流入十二指肠而进入血液的病理状态。临床可表现为瘙痒、乏力、尿色加深和黄疸等,早期常无症状仅表现为血清ALP和GGT水平升高,病情进展后可出现高胆红素血症,严重者可导致肝衰竭甚至死亡。各种原因使肝脏病变导致以胆汁淤积为主要表现的肝胆疾病统称胆汁淤积性肝病,而胆汁淤积本身也会进一步加重肝脏的损害,与肝脏疾病高度相关。然而,临床上针对胆汁淤积型肝病的用药选择并不多,自1997年熊去氧胆酸UDCA被FDA批准用于治疗胆汁淤积肝病后,直到2016年才有奥贝胆酸（OCA）问世作为临床上对UDCA不应答的患者的补充药物。该2药物均为胆汁酸衍生物,参与了体内胆汁酸胆汁酸代谢平衡的调控。OCA作为核受体胆汁酸受体法尼醇X受体（FXR）的激动剂在体内激活FXR信号后,诱导了胆汁酸信号通路上诸多信号的变化,如胆汁酸合成负反馈抑制的重要两条信号路:激活肝源FXR-SHP信号及肠源FXR-FGF15/19信号可共同抑制胆汁酸合成限速酶CYP7A1的表达。FXR激动剂还能作用于胆汁酸肝肠循环通路上相关受体信号,加快胆汁酸从肝内排泌,减少回肠胆汁酸吸收以及肝对胆汁酸的重新摄入,从而改善肝内胆汁淤积的状况。OCA的成功上市促使了近年来大量对体内核受体FXR相关信号通路与体内胆汁酸代谢异常造成的相关疾病关系的研究,如胆汁淤积型肝病和非酒精性脂肪肝。可以说寻找对FXR有调控作用的药物目前已是胆汁淤积相关疾病药物开发的重要热点方向之一。小伞虎耳草Saxifraga umbellulata Hook.f.et Thoms.（SU）为藏医临床用于肝胆疾病的特色常用药材“松蒂”的基原之一,在藏医药古籍《四部医典》《图鉴》等中均有记载,《度母本草》《晶珠本草》等记载其功效“清热,治‘培根’与‘赤巴’合并症,肝、胆热症及创伤。藏医经典《月王药诊》认为肝胆等脏腑疾病及与此相关的热性疾病属于“赤巴”病。“赤巴”功能紊乱,易引起胆病发作。而胆病反过来又会影响肝的疏泄功能,所以胆病不仅要从肝论治,同时,肝病也可从胆论治。这与现代基于胆汁酸代谢调控治疗胆汁淤积相关疾病的治疗策略也是一致的。本课题组前期对SU的化学研究表明其含有槲皮素类黄酮成分,姜黄素类衍生物,XDSY类葫芦烷型类三萜皂苷和齐墩果烷型皂苷类成分等多种类型成分(其中部分成分已有保肝利胆的[53-57]研究报道);并证实SU具有抗胆汁淤积模型小鼠的肝损伤作用,其提取物对胆汁酸代谢通路上的某些信号有调控作用,但其作用机制尚有待阐明。为此,本课题基于对胆汁酸代谢有重要调控作用的FXR相关信号通路对SU治疗胆汁淤积及相关疾病的作用机制进行了研究。研究目的:探讨SU总提物及其所含代表性成分对α-萘异硫氰酸酯（ANIT）所致小鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用及其机制,为藏药“松蒂”治疗胆汁淤积相关疾病提供药理学依据。实验方法:1.C57BL/6J小鼠连续5天灌胃给予小伞虎耳草提取物高剂量3.12 g/kg（以生药量计）,低剂量1.56 g/kg（以生药量计）治疗。第3天,灌胃给予单剂量α-萘异硫氰酸盐ANIT（45 mg/kg）造模,测定胆汁淤积型肝损伤血清标记物谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血清碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）和总胆汁酸（TBA）的含量;HE染色法观察小伞虎耳草提取物干预后肝组织病理变化;酶联免疫试剂盒检测法检测肝组织匀浆中TNFα,NF-κB,IL-6,NRF2浓度。采用Western Blot法,检测小鼠肝组织以及回肠组织中核受体FXR介导的相关胆汁酸代谢蛋白CYP7A1,MRP2,BSEP,SHP,FXR,FGF15,FGFR4表达水平。2.基于人肝癌细胞Hep G2,检测SU中一些代表性成分对细胞内胆汁酸代谢相关信号蛋白表达的影响。3.利用UPLC-3QMS对胆汁淤积模型小鼠肝组织胆汁酸代谢组进行研究,探讨SU总提物对小鼠胆汁酸代谢轮廓的影响。研究结果:1.胆汁淤积小鼠模型造模:本研究以胆汁淤积模型C57BL/6J小鼠,采用ANIT诱导胆汁淤积并产生肝损伤造模。经检测,与空白组相比,血清谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、血清碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）和总胆汁酸（TBA）浓度极显著升高（P<0.01）,肝组织切片可见肝细胞排列紊乱、出现水肿、变性和坏死以及炎症细胞浸润,肝匀浆中TNFα,NF-κB,IL-6显著升高,Nrf 2极显著降低（P<0.01）,表明造模成功。2.SU提取物抗胆汁淤积型肝损伤作用作用机制:实验结果显示,与模型组相比,血清中肝损伤以及和胆汁淤积生化指标（AST、ALT、ALP、DBIL、TBIL、TBA）显著降低（P<0.01）。小鼠肝脏病理切片结果显示;SU提取物高剂量可改善模型小鼠肝脏病理变化,抑制肝匀浆组织中炎症指标TNFα,NF-κB,IL-6的异常升高（P<0.01）,促进小鼠转录因子E2（Nrf 2）的降低（P<0.01）。Western blot实验结果表明;与模型组相比,SU高剂量组能显著升高肝组织中相关合成和转运蛋白SHP、FGFR4、BSEP、MRP2的表达（P<0.05）,降低CYP7A1的表达（P<0.05）。而在回肠组织中,SU高剂量组能有效促进回肠组织中FXR和FGF15、TGR5的表达（P<0.05）。3.SU中代表性单体成分的作用机制:实验结果表明,与空白组相比,SU部分代表性成分XDSY能显著上调人肝癌细胞SHP（P<0.05）的表达,抑制CYP7A1的表达（P<0.01）,PE3能显著上调MRP2,FXR的表达（P<0.01）,HE33能显著上调BSEP的表达（P<0.01）,HE11则能显著升高FXR的表达（P<0.01）。4.SU提取物对肝脏胆汁酸谱的影响:实验结果表明,无论从总胆汁酸、各类型胆汁酸的含量和组成,还是从各单个胆汁酸含量和组成方面看,SU给药组和阳性药组均可回调模型小鼠肝脏胆汁酸谱至与正常组接近的胆汁酸谱,通过一元和多元统计分析,确认了SU与阳性药OCA回调ANIT造成的异常升高或者降低的胆汁酸,与模型组比较,T-βMCA、TCA、T-ωMCA、ωMCA、βMCA、CA等胆汁酸的含量明显降低,CDCA的含量则明显提高。研究结论:1.SU提取物可降低ANIT致胆汁淤积模型小鼠血清中的AST、ALT、ALP、DBIL、TBIL、TBA的含量,降低了肝匀浆中TNFα、NF-κB、IL-6的含量,升高了肝匀浆中Nrf 2的含量;说明给予SU提取物及OCA持续治疗可减轻ANIT引起的急性组织炎症,纠正ANIT引起的胆汁酸体内平衡障碍,减少肝组织炎症损伤发挥其治疗胆汁淤积的作用,表明SU具有显著的抗胆汁淤积型肝损伤作用。2.SU抗胆汁淤积的作用机制可能是通过调节FXR相关胆汁酸合成、代谢、转运相关靶点。其中,肝源SHP-CYP7A1和肠源FXR-FGF15-FGFR4-CYP7A1信号通路的激活共同抑制胆汁酸合成,肝组织内转运蛋白MRP2、BSEP表达的升高促进了胆汁酸从肝往外排泌,回肠部TGR5的表达升高也促进了胆汁酸代谢回到基础水平,FXR和TGR的共同激活可能抑制了NF-κB通路,从而降低肝脏炎症因子水平（如TNF-α,IL-6）。3.SU含有对FXR相关信号通路FXR、SHP、CYP7A1、BSEP、MRP2调控的活性成分,其中XDSY、PE3、HE11通过对FXR-SHP-CYP7A1通路的影响而产生对胆汁酸合成的抑制作用,PE3和HE33通过激活BSEP和MRP2而产生促进胆汁酸从肝向外排泌的作用。本研究初步阐明上述成分系SU提取物抗胆汁淤积型肝损伤作用药效物质。4.SU能够回调肝脏胆汁酸谱至正常状态:模型小鼠的肝内胆汁酸总量相对于正常组显著升高,造成了肝内胆汁淤积,与血清生化指标检测一致。无论从总胆汁酸含量、各类型胆汁酸含量和组成,还是从各单个胆汁酸含量和组成方面看,SU组和阳性药（OCA）组均可以回调模型小鼠肝脏胆汁酸谱至与正常组接近的胆汁酸谱;通过一元和多元统计分析,确认了SU与OCA回调ANIT造成的多个异常升高或者降低的胆汁酸。模型小鼠肝脏中T-βMCA、TCA、T-ωMCA、ωMCA、βMCA和CA含量显著增高,这些胆汁酸在体内含量的增高都被认为对FXR信号有拮抗作用,而SU提取物和OCA干预后,造成的FXR拮抗作用的胆汁酸含量下降将有利于FXR抑制信号的释放,从而激活FXR相关信号通路,减少胆汁酸合成、促进胆汁酸排泌和降低肝脏炎症水平。而另一造成FXR信号激活的证据是肝脏内是用药后CDCA含量的回调升高,而CDCA是体内FXR最强的天然激活配体。