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木瓜蛋白酶又称为木瓜酶,是番木瓜中含有巯基的一种特异性蛋白水解酶,被广泛应用于食品、医药等领域,但使用传统分离纯化木瓜蛋白酶的方法不能获得高活性、高纯度的木瓜蛋白酶,因此,对于获得高品质木瓜蛋白酶分离方法的研究具有非常重要的实际意义。双水相体系作为一种简单、高效的分离纯化技术被广泛应用于蛋白质或酶的分离纯化,但目前对双水相体系的研究大多集中在PEG/盐和离子液体/盐三元双水相体系,而对于四元双水相体系的报道相对较少。离子液体双水相体系主要集中在咪唑类和吡啶类离子液体双水相体系,对于季铵型离子液体双水相体系报道较少。本文研究了添加不同阴阳离子组装的季铵型离子液体对PEG/盐双水相体系相行为的影响,测定了双水相体系的液液相平衡数据,筛选出成相能力和木瓜蛋白酶分离纯化效果最佳的双水相体系,通过响应面优化分离纯化木瓜蛋白酶的工艺条件,并对木瓜蛋白酶萃取前后的结构进行表征,最后用SDS-PAGE电泳验证实验结果,内容如下:(1)[N2222]BF4的合成及其对PEG-NaH2PO4·2H2O双水相系统相行为的影响合成季铵盐离子液体[N2222]BF4离子液体并对其进行1H NMR表征和纯度验证;用浊点法测定 PEG/NaH2PO4·2H2O和PEG/NaH2PO4·2H2O/[N2222]BF4 双水相体系的相图,并通过Merchuk方程对双节点数据进行关联,考察添加[N2222]BF4对PEG/NaH2PO4·2H2O三元双水相体系相行为的影响;结果表明,双节点曲线数据的拟合度都在0.997以上,关联度很好;双水相区域的面积由大到小分别为:PEG6000+4wt%IL(IL 代表[N2222]BF4)>PEG4000+4wt%IL>PEG2000+4wt%IL>PEG6000>PEG4000>PEG2000>PEG600+4wt%IL>PEG600>PEG400+4wt%IL>PEG400,本章为后续双水相体系的选择奠定了理论基础。(2)PEG/二水合磷酸二氢钠/季铵型离子液体双水相分离纯化木瓜蛋白酶的研究构建PEG/NaH2PO4·2H2O三元双水相体系及PEG/NaH2PO4·2H2O/季铵型离子液体四元双水相体系,使用浊点法绘制相图,并通过Merchuk方程对双节点曲线数据进行关联,由酶分离纯化效果筛选出最佳PEG4000/NaH2PO4·2H2O/[N2222]BF4双水相体系;实验结果显示木瓜蛋白酶倾向于分配到富含磷酸盐的下相,通过响应面法优化木瓜蛋白酶的分离纯化条件,以总评归一值(OD值)为评价指标,得到双水相分离纯化木瓜蛋白酶的最佳优化条件为:PEG4000 16.4 wt%,NaH2PO4·2H2O 13.7 wt%,pH 6.22,温度60℃,酶浓度12.0 mg/ml。在该条件下木瓜蛋白酶的纯化因子从1.331(不含ILs)增加到3.380(含4 wt%[N2222]BF4)。总评OD值为0.9979,最大预测OD值为0.9994,偏差率为-0.15%.因此,实验建立的模型可以很好地预测实验结果。为验证此模型的实际应用效果,采用同样的双水相体系分离纯化木瓜乳汁粗提酶,结果表明,木瓜乳汁粗提酶的纯化因子由3.517提高到12.04。(3)PEG/硫酸铵/季铵型离子液体双水相分离纯化木瓜蛋白酶的研究构建PEG/(NH4)2SO4三元双水相体系及PEG/(NH4)2SO4/季铵型离子液体四元双水相体系,浊点法绘制相图,研究不同离子液体的结构对PEG/硫酸铵三元双水相体系相行为的影响,测定了双水相的系线(TL)组成及系线长(TLL),由单因素筛选出分离纯化效果最佳的PEG400/(NH4)2/[N1111]Br双水相体系,通过响应面法优化了酶分离纯化条件;结果表明,木瓜蛋白酶分配于双水相体系的上相,最佳分离纯化条件为:盐浓度20.20 wt%,PEG400浓度20.25 wt%,pH 7.0,在此条件下,通过比较木瓜乳汁粗提酶在两种体系中的分离纯化效果得出,木瓜乳汁粗提酶的纯化倍数从从2.13倍(不含IL)增加到13.51倍(含4wt%[N1111]Br);酶活性回收率酶活性回收率从64.2%增加到96.46%,经SDS-PAGE分析表明,木瓜乳汁粗提酶经过纯化后的杂蛋白条带明显减少,经PEG/(NH4)2SO4/季铵型离子液体四元双水相体系纯化后的木瓜蛋白酶条带浓度明显大于经PEG/(NH4)2SO4三元双水相体系纯化后的木瓜蛋白酶条带浓度,验证了酶分离纯化效果。(4)季铵离子液体/盐双水相分离纯化木瓜蛋白酶的研究在前三章的基础上,构建季铵离子液体/盐双水相体系,测定双水相上、下相组分含量及系线长,由酶分离纯化效果筛选出最佳[N4444]Br/(NH4)2SO4双水相体系,由响应面法优化得到木瓜蛋白酶的分离纯化最优条件:(NH4)2SO4 16.00 wt%,[N4444]Br 19.55 wt%,pH 6.94,该条件下,分别添加商品酶和木瓜乳汁粗提酶,比较两种酶的分离纯化结果得,添加商品酶的双水相体系的蛋白质回收率为87.65%,酶活力回收率为96.04%,纯化因子为2.87。添加木瓜乳汁粗提酶的双水相体系的蛋白质回收率为79.32%,酶活力回收率为95.73%,纯化因子为13.96。综上所述,此双水相体系对木瓜乳汁粗提酶具有更好的纯化效果,对木瓜蛋白酶在萃取前后UV-vis吸收光谱和FT-IR吸收光谱的检测发现,其特征吸收峰未发生改变,表明此体系的萃取条件温和,不会造成木瓜蛋白酶的构象的改变。论文采用分别采用PEG/盐/季铵型离子液体四元和季铵型离子液体/盐三元双水相体系分离纯化木瓜蛋白酶,分别探讨了木瓜蛋白酶在富含磷酸盐的下相和富含PEG或季铵型离子液体上相中的分配行为,比较了不同结构离子液体的添加对双水相相行为的影响,筛选出了最佳分离纯化体系,具有一定的创新性。