目的:葡萄糖是维持机体正常生理活动和细胞增殖的重要能量来源。葡萄糖代谢主要有氧化磷酸化、糖酵解和有氧糖酵解三种形式,而肿瘤细胞以有氧糖酵解为主要的代谢方式,这又被称为“瓦伯格效应”。肿瘤细胞为什么会选择低效的有氧糖酵解代谢方式,目前仍存在争议。本研究旨在从生物化学角度去阐述瓦伯格效应存在的原因及其对肿瘤细胞生存及肿瘤生长的影响和作用。方法:1.利用可以实时检测细胞凋亡的工具(GC3AI)和PI来检测葡萄糖缺乏时细胞的死亡情况。2.利用RNA干扰技术降表达MCF-7细胞的Caspase或者用Caspase的抑制剂,观察其对无糖诱导细胞坏死的影响。3.MCF-7细胞过表达BCL-XL/BCL-2保护线粒体,观察其对无糖诱导细胞坏死的影响。4.用线粒体氧化呼吸链抑制剂处理细胞,观察其对TNF-a诱导的细胞死亡的影响。5.在营养缺乏的培养基中单独添加不同的氨基酸和柠檬酸循环中间代谢产物,观察不同物质代谢对TNF-a诱导的细胞死亡的影响。6.改变细胞内外p H值,观察对无糖诱导的细胞坏死的影响。7.用Bafilomycin A或CQ处理细胞,观察对无糖诱导的细胞坏死的影响。8.利用CRISPR/Cas9技术敲除Hela或4T1细胞内LDH和PKM基因,观察其对乳酸产生、细胞增殖、葡萄糖代谢及谷氨酰胺代谢的影响。9.小鼠皮下接种4T1/Cas9,4T1/PKM-KO,4T1/PKM-KO-h PKM1和4T1/PKM-KO-h PKM2细胞,观察小鼠成瘤情况及肿瘤生长速度,免疫组化检测PKM表达情况结果:1.TNF-α促进MCF-7细胞发生葡萄糖剥夺诱导的细胞坏死。2.线粒体损伤促进葡萄糖剥夺诱导的细胞坏死。3.在葡萄糖剥夺情况下,线粒体生成ATP对于TNF-α诱导的细胞坏死是必须的。4.线粒体生成ATP相关的代谢过程对TNF-α诱导的细胞坏死起决定性作用。5.线粒体ATP生成驱动的质子平衡对TNF-α促进的细胞坏死起决定性作用。6.在葡萄糖缺乏的情况下,线粒体ATP生成驱动严重的溶酶体碱化是TNF-α促进的细胞坏死所必须的。7.葡萄糖是维持质子平衡的重要来源。8.PKM1和PKM2都可以调节乳酸分泌。9.反瓦伯格效应主要由基质中的PKM2介导。10.PKM2抑制葡萄糖进入乙酰辅酶A的路径。11.PKM2促进谷氨酰胺转换成乙酰辅酶A。结论:我们的研究结果显示葡萄糖糖酵解是产生质子的主要来源。葡萄糖缺乏会引起质子的供应不足,但是线粒体电子传递链仍在不断的消耗质子,而且线粒体损伤会加剧质子的消耗,这就会引发代偿性的溶酶体质子流出和进而导致的溶酶体PH值上升。这种溶酶体碱化是否会引起细胞的凋亡或坏死,主要取决于细胞酸碱化的程度。综上所述,我们的研究结果在糖酵解、线粒体和溶酶体之间建立了代谢连接,并且揭示了葡萄糖有氧糖酵解在维持质子内稳态以及在维持细胞正常存活过程中起着重要的作用。在此基础上,我们建立了一个基于质子平衡的细胞代谢状态的理论模型。我们的模型表明,由于增殖细胞活跃的合成代谢会消耗大量的质子,瓦伯格效应的重要作用就是维持增殖细胞内的质子平衡。该模型还预测了肿瘤相关基质细胞中的“反瓦伯格效应”,这与我们先前的观察结果一致,并得到了我们的结果的支持。我们发现PKM1和PKM2都可以使有氧糖酵解进行,但是PKM2比PKM1更能有效的将葡萄糖转化为乳酸。因此PKM2减少了细胞内葡萄糖的利用,特别是用于柠檬酸产生的部分,从而增加了α-酮戊二酸/柠檬酸的比例,进而促进谷氨酰胺通过还原途径生成乙酰辅酶A。总而言之,我们的结果显示PKM2在维持质子平衡和促进谷氨酰胺还原代谢方面发挥着关键作用,同时这对肿瘤细胞内PKM2高表达的生理意义提供了一种更好的解释。