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嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila, Ah)是重要的水生动物病原菌,给水产养殖业造成极大的经济损失,同时还是重要的人畜共患病病原菌。该菌毒力因子众多,致病机理复杂。四膜虫作为一种有效的环境毒理检测工具,能够直接或间接反映细菌代谢产物的毒力大小。本文探寻了嗜水气单胞菌毒力因子间的相互关系,并通过研究其与四膜虫之间的互作,评估了四膜虫作为嗜水气单胞菌宿主模型的潜力。试验选取嗜水气单胞茵的3种主要胞外毒力因子-气溶素(Aer)、细胞兴奋性肠毒素(Alt)和丝氨酸胞外蛋白酶(Ahp),设计并合成3对引物,对实验室现有的84株嗜水气单胞菌进行PCR检测。根据3种胞外毒素的分布情况,可将84株嗜水气单胞茵分离株分为7个毒力基因型：aer+alt+ahp+占61.9%(52/84);aer+alt+ahp占14.3%(12/84);aer+alt-ahp+占10.7%(9/84)：aer-alt+ahp+占4.8%(4/84)；aer-alt-ahp+占3.6%(3/84)：aer+alt-ahp占2.4%(2/84)：aer-alt-ahp占2.4%(2/84)。其中以3种胞外毒素基因扩增均阳性的菌株比例最高。随机选取不同基因型的共26株代表菌株做斑马鱼攻毒试验。结果基本表明,毒力因子之间表现出协同作用,且毒力基因越多的嗜水气单胞菌,其LDso越低,对斑马鱼的致死率越高。试验中首次提出用aer-alt-ahp三基因联合检测法预测嗜水气单胞菌的毒力。在斑马鱼攻毒试验的基础上,筛选得到强毒株BSK-10和弱毒株NJ-4,将它们分别与四膜虫相互作用,通过测量OD450,绘出虫外细菌12h的生长曲线。再将两株Ah分别与饥饿的四膜虫共培养,用血细胞计数板记录48h内四膜虫的数量变化,用平板计数法绘制虫内细菌的生长曲线。实验结果表明,两株Ah分别与四膜虫共培养,虫外强毒株BSK-10的生长不受到四膜虫的影响,而弱毒株NJ-4在2h生长就受到严重抑制,随后生物量急剧下降。与强毒株共培养的四膜虫数量不断减少,48h虫体几乎全部死亡,虫内细菌有明显的增殖过程；与弱毒株共培养的四膜虫数量有少量减少,虫内菌数量有小幅变动但基本稳定。分别取BSK-10和NJ-4的24h培养上清加入四膜虫培养液中,细胞计数板记录四膜虫的数量变化,结果显示12h内,与BSK-10上清作用的四膜虫死亡率高于与NJ-4上清作用的四膜虫的死亡率。实验表明,嗜热四膜虫对嗜水气单胞菌的胞外产物敏感,且强弱毒株对四膜虫的作用有明显差异,说明四膜虫具有成为评估嗜水气单胞菌毒力的宿主模型的潜力。将绿色荧光蛋白(GFP)标记的嗜水气单胞菌J-1株(AhJ-1GFP),与饥饿的四膜虫共培养,4-6h后,在荧光显微镜下,可见虫体内有大量包含荧光细菌的食物泡。透射电镜显示,弱毒株与虫体共培养,四膜虫的食物泡均完整呈圆形,细菌形态大多不规则,有被消化倾向；强毒株与虫体共培养,四膜虫的部分食物泡边界不明显且不呈圆形,其中的细菌形态规则,有破食物泡而出的倾向。扫描电镜显示强毒株作用下的四膜虫表面纤毛大量脱落,且似乎有细菌分泌物包裹虫体,而弱毒株作用下的四膜虫纤毛舒展,旺盛,偶有脱落,表面沟回清晰,与正常四膜虫无明显差异。选用嗜水气单胞菌参考株J-1,与四膜虫分别在PBSS和SM培养基中共培养,6h后检测虫体内外细菌毒力基因aer、ahp的表达情况。结果显示,两种培养基条件下,虫内菌的毒力基因表达均上调；PBSS环境中,虫外细菌的毒力基因表达也呈小幅上调,而SM环境中,虫外细菌的毒力基因表达程度与原先基本保持一致。试验结果表明,嗜水气单胞菌对四膜虫的作用很可能是通过上调自身毒力基因表达而产生更多的胞外毒素,从虫体内外两方面限制了四膜虫的吞噬能力并进一步毒害四膜虫。