皮肤损伤愈合是典型的组织损伤修复的过程,其大致可以分为三个阶段:炎症期、细胞的活化增殖迁移期和重建修复期,其各阶段是相互联系,相互影响的。皮肤的损伤愈合过程连续而复杂,是一个在时间和空间上受一定的细胞生物因子所调控的生物学过程,有大量细胞因子和炎症介质的参与其间,多种炎性细胞的激活呈一定的时间规律性,首先中性粒细胞开始募集,然后巨噬细胞聚集,最后成纤维细胞和血液中的纤维细胞(circulating fibrocytes,CFCs)转化为肌成纤维细胞。　　 内源性大麻素系统主要由大麻素受体(cannabinoid receptor,CBR)、内源性大麻素(endocannabinoid)和合成与降解内源性大麻素的酶组成。CBR分为1型大麻素受体(type1 cannabinoid receptor,CB1R)和2型大麻素受体(type2eannabinoid receptor,CB2R)两个亚型。基因克隆研究发现CB2R与CB1R的主要区别在于其氨基酸序列、信号转导机制、器官分布及对某些激动剂和抑制剂敏感度的不同。CB2R同样可以激活多重细胞内信号转导通路,包括通过抑制腺苷酸环化酶、抑制钙通道、激活钾通道、激活MAP激酶通道抑制cAMP的生成。皮肤损伤愈合过程中,巨噬细胞发挥了关键作用,同时CB2R在巨噬细胞中也表达,因此,我们可以推测,参与皮肤损伤愈合过程中的单核细胞亦可能表达CB2R,并可能调节巨噬细胞发挥作用。大麻素受体CB2还在肝纤维化的星形细胞和肝肌成纤维细胞中表达,通过抑制增殖和促进凋亡,发挥了重要的抗纤维化的作用。　　 目的：　　 本研究旨在探讨:①CB2R在皮肤损伤愈合过程中时间依赖性的蛋白表达和分布的特征;②CB2R在巨噬细胞和肌成纤维细胞中的表达。③死后不同时间对检测生前皮肤损伤后CB2R表达的影响。期望通过这些研究,为进一步研究CB2R在皮肤损伤愈合过程中的生物学功能奠定基础,并探讨CB2R在法医实践中用于推断损伤时间的司能性。　　 材料与方法：　　 一、动物模型建立与分组　　 健康成年雄性BALB/c小鼠70只,体质量30～35g,随机分为14组。其中皮肤切创分为13个时间段组,另一组为正常对照组,每组均为5只小鼠。腹腔注射戊巴比妥钠,背部剪毛处理后,常规手术消毒,在背部中央做一纵行1.5cm长皮肤全层切口,深达筋膜。伤后每只小鼠单独饲养,避免细菌感染。分别于伤后0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、3d、5d、7d、10d、14d、17d、21d将小鼠脱颈椎处死,取创口处1.5cm×1.0cm皮肤组织,正常对照组小鼠麻醉后背部剪毛,不做切创,观察至21d,脱颈椎处死,取相同部位同等大小皮肤。各组5只小鼠的皮肤样本被均分为两部分,一部分用于石蜡切片的HE染色、免疫组织化学和双重免疫荧光染色,另一部分用于Western blot和Real-Time RT-PCR检测。　　 为观察不同死后间隔时间对CB2R检测的影响,另取健康成年雄性BALB/c小鼠40只,体质量30～35g,随机分为8组,每组均为5只小鼠。在生前伤5d后脱颈椎处死,置22℃室温,湿度70％,以死后放置时间不同,分别于死后0h、0.5h、1h、3h、6h、12h、1d、3d提取皮肤样本进行Western blot和Real-Time RT-PCR检测。　　 二、HE及免疫组织化学染色　　 所取皮肤样本在4％多聚甲醛(pH7.4)中固定12h,经脱水、透明,石蜡包埋,制作5μm厚度连续切片,进行HE染色及CB2R的免疫组织化学染色。　　 三、免疫荧光染色　　 石蜡切片分别进行CB2R和F4/80、CB2R和α-SMA的双重免疫荧光染色。　　 四、CB2R和GAPDH蛋白检测　　 提取样本总蛋白,上样量为50μg。转印到PVDF膜上后用5％脱脂奶粉封闭,用兔抗小鼠CB2R多克隆抗体(1:400)、小鼠抗小鼠GAPDH单克隆抗体(1:1000)4℃孵育过夜,分别用相应的二抗室温孵育,ECL发光,蛋白条带经电泳凝胶图像分析系统(MF-ChemiBIS3.2,DNR Bio-Imaging Systems,ISR)扫描,用Scion Image软件(Scion Corporation,Maryland,USA)检测CB2R灰度值与GAPDH灰度值,两者比值为其相对蛋白定量。　　 五、Real-Time PCR检测CB2R和β-actin mRNA　　 (一)RNA提取　　 以Trizol法提取细胞总RNA。紫外可见光分光光度计(Nano Photometer,IMPLEN,Germany)测定OD260/OD280值和RNA浓度,并将样品部分RNA稀释成0.5μg/μl。　　 (二)反转录反应　　 反转录反应体系见表1。　　 ()反应条件:37℃,15min;85℃,5sec　　 (二)Real-time RT-PCR反应　　 (三)Real-time RT-PCR反应设计特异性引物见表2,Real-time RT-PCR反应体系见表3。表2,引物序列和产物长度　　 六、统计学分析　　 用SPSS13.0 for Windows对数据进行单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义。　　 实验结果：　　 一、皮肤切创愈合过程中形态学所见　　 小鼠皮肤切创后创口哆开伴明显出血及渗液。伤后6h,创口稍干燥。伤后12h,可见创口已少量结痂。伤后1d,创口已无渗血、渗液,创口皮肤干燥,可见完整痂皮。伤后3d,创缘皮肤收缩、平整,红肿消退。伤后5～7d,痂皮与创缘皮肤分离,部分已剥离,创口表面被增生的上皮覆盖,可见皮下红色肉芽组织。伤后10d,创口已呈线形愈合,无渗出,并明显短缩。伤后14d,创口已完全愈合,仅留线状瘢痕,部分小鼠创口皮肤稍隆起,质地较韧。　　 二、皮肤切创后不同死后间隔时间内形态学所见　　 伤后5d的皮肤切创,死后即刻见痂皮与创缘皮肤分离,部分已剥离。死后6h～12h创壁变化较小,较湿润,皮肤及皮下组织未见腐败。死后24～48h皮肤变薄,创壁略变干,尸体腐败,尸臭、尸绿出现;取材时见肌肉部分混浊、变软。死后3d,尸体腐败显著,取材时见肌肉混浊、变软。　　 三、皮肤切创愈合过程中病理组织学所见　　 在对照组小鼠真皮内可见少量静止的成纤维细胞(fibroblastic cells,FBCs)。伤后0.5 h,伤口周围真皮内可见间质疏松,但未见炎细胞的浸润。伤后1h多形核细胞(polymorphonuclear cells,PMNs)出现在伤口部位血管的周围,PMNs于伤后3～6 h显著增多,伤后12h达到浸润高峰。伤后1d和3d,大量圆形的单核细胞(mononuclcar cells,MNCs)聚集于伤口的边缘。伤后3d,FBCs也开始出现在伤口底部,于伤后5d显著增多,伤后7d达到峰值。伤后5～10d,肉芽组织形成,其内可见大量的毛细血管和FBCs。此外,伤后7d,新生表皮已完全覆盖创口。伤后10d,新生血管和FBCs数量开始减少。伤后14～21d,肉芽组织逐渐转变为瘢痕组织。　　 四、免疫组织化学结果　　 对照组小鼠皮肤CB2R分布于表皮、毛囊、皮脂腺、血管内皮及真皮中FBCs。皮肤切创伤后1～12h,可见少数PMNs有CB2R表达。随着损伤时间的延长,阳性多核粒细胞被阳性MNCs和FBCs取代。伤后1d,大量MNCs呈CB2R阳性。伤后3d,呈CB2R阳性的FBCs开始出现于创口周围。伤后5～14d,CB2R主要于表达在FBCs中。伤后17～21d仍然可见一些阳性的成纤维细胞呈CB2R阳性。另外,在损伤愈合期间,新生血管平滑细胞也显著表达CB2R。　　 五、双重免疫荧光染色结果　　 对照组小鼠皮肤可见少许CB2R和F4/80双阳性细胞;伤后1d和3d,大量CB2R阳性的巨噬细胞募集于伤口局部。随着损伤时间的延长,CB2R阳性的巨噬细胞逐渐减少。伤后0.5h到伤后3d,未见α-SMA阳性的肌成纤维细胞分布。伤后5d呈CB2R阳性的肌成纤维细胞出现于损伤区;伤后7d达到峰值。随着损伤时间的延长,呈CB2R阳性的肌成纤维细胞逐渐减少;伤后21d,未见CB2R阳性的肌成纤维细胞。　　 六、Western blot结果　　 对照组小鼠皮肤有CB2R阳性条带。皮肤切创伤各组CB2R蛋白表达强度有一定时间规律性。伤后5d,达到高峰:伤后7d,开始下降;到伤后21d,CB2R阳性条带基本一致于正常对照组的表达水平。　　 CB2R在死后各时间组均有阳性条带,CB2R大约位于34kD处,死后各时间组CB2R蛋白表达相对水平有一定时间规律。与死后0h组比较,死后6h组CB2R.蛋白表达相对水平开始显著降低;至死后3d,CB2R蛋白表达相对水平降至最低值。　　 七、Real-time RT-PCR结果　　 损伤组皮肤组织中CB2R mRNA自0.5h即开始表达升高,伤后5d到达峰值,是正常对照组的4.47倍,随后CB2R表达逐渐减弱,至伤后21d基本一致于正常对照组的表达水平。　　 小鼠切创5d后不同死后间隔时间CB2R mRNA在皮肤组织中的表达随时间变化。死后0.5h、1h、3h的皮肤组织中与相应生前损伤组CB2R mRNA无显著性差异。和对照组比较,死后6h组CB2R mRNA表达相对水平开始降低;至死后3d,CB2R mRNA表达相对水平降至最低值。　　 结论：　　 1、正常小鼠皮肤的表皮、毛囊、皮脂腺、皮肌层、血管平滑肌细胞、神经纤维外膜及神经纤维束束膜呈CB2R的阳性分布。　　 2、小鼠皮肤切创愈合过程中,巨噬细胞和肌成纤维细胞表达CB2R,提示CB2R可能参与对巨噬细胞和肌成纤维细胞生物学功能的调节,影响皮肤损伤愈合的过程。　　 3、小鼠皮肤切创愈合过程中,CB2R表达变化具有时间规律性,并且死后6h内CB2R稳定存在于皮肤组织中,有望用于皮肤损伤时间的推断。