论文部分内容阅读
第一部分ABCA1基因R219K多态性与血脂水平和腹主动脉瘤的关系研究[目的]研究三磷酸腺苷结合盒转运子A1(Adenosine triphosphate binding cassette trarnsporter A1,ABCA1)基因R219K多态性位点在健康人群和腹主动脉瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)患者中的分布特点,探讨R219K各基因型与血脂水平和AAA的关系。[方法]实验分为两组:126例来源于我院血管外科的AAA患者(疾病组)和119例来源于我院健康体检中心的健康人群(对照组)。采集各样本外周血分析总胆固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三脂(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C)和载脂蛋白 A-I(apolipoprotein A-I,ApoA-I)水平,利用PCR及基因测序技术检测各样本ABCA1基因R219K多态性,并比较两组间基因型和等位基因的分布特征,并分析ABCAl基因R219K多态性与血脂和AAA的关系。[结果]①疾病组与对照组相比,TG和LDL-C水平明显更高(p<0.05),HDH-C和ApoA-I水平更低(p<0.05);②两组间ABCA1基因R219K多态性分布频率的比较结果是:RR与KK基因型,R与K等位基因的分布频率具有统计学差异(p<0.05),RK基因型分布差异无统计学意义(p>0.05);③疾病组中KK和RK基因型携带者的HDL-C和ApoA-I水平高于RR基因型携带者(p<0.05),但TC、TG和LDL-C水平无显著差别(p>0.05);④Logistic回归分析显示ABCA1基因R219K多态性中R等位基因可能与AAA发病相关(OR= 3.53,p<0.05)。[结论]ABCA1基因R219K多态性KK和RK基因型与HDL-C和ApoA-I水平有关。ABCA1基因R219K多态性与AAA发生存在一定相关性,R等位基因可能是AAA发病危险因素之一。第二部分ABCA1基因对主动脉平滑肌细胞凋亡的影响及与动脉瘤相关长链非编码RNA的关系[.目的]在人主动脉平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)中过表达和敲降ABCA1基因后,探讨其对主动脉VSMCs凋亡的影响。同时检测过表达和敲降ABCA1基因后VSMCs中与动脉瘤相关的长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)ANRIL、HIF1A-AS1 和 AK056155 的表达水平,探寻它们之间的相互关系。[方法]利用RNA提取、逆转录和PCR技术在人主动脉VSMCs中钓取ABCA1基因,通过pEGFP-N3构建过表达载体转染人主动脉VSMCs。应用qRT-PCR和Western blot技术验证ABCA1表达情况。在过表达ABCA1基因的主动脉VSMCs中应用ANNEXIN V-FITC染色结合流式细胞术检测细胞凋亡情况,并应用qRT-PCR 技术检测 LncRNAANRIL、HIF1A-AS1 和 AK056155 的表达水平。利用siRNA技术在人主动脉VSMCs中敲降ABCA1基因。应用qRT-PCR技术鉴定各siRNA敲降ABCA1的效率,采用敲降效率最高的siRNA做后续实验。在敲降ABCA1基因的主动脉VSMC中应用ANNEXIN V-FITC染色结合流式细胞术检测细胞凋亡情况,并应用qRT-PCR技术检测LncRNA ANRIL、HIF1A-AS1和AK056155的表达水平。[结果]成功构建ABCA1-pEGFP-N3载体。利用该载体转染人主动脉VSMCs 24h后,转染组各检测结果显示:①ABCAlmRNA-水平和蛋白表达水平显著高于对照组(均为p<0.05);②主动脉VSMCs凋亡率较对照组下降(p<0.05);③主动脉VSMCs中LncRNAANRIL、HIF1A-AS1和AK056155水平均较对照组减少(均为p<0.05),其中LncRNAANRIL变化最显著。合成3个siRNA-ABCA1转染人主动脉VSMCs后,qRT-PCR验证siRNA-ABCA1-1的干扰效率最佳,采用其进行后续实验。siRNA-ABCA1-1转染组各检测结果显示:①ABCA1 mRNA和蛋白表达水平明显低于对照组(均为p<0.05);②主动脉VSMCs凋亡率较对照组增加(p<0.05);③主动脉VSMCs中LncRNA ANRIL、HIF1A-AS1和AK056155的表达水平均较对照组增加(均为p<0.05),其中LncRNAANRIL变化最显著。[结论]①成功构建过表达和敲降ABCA1基因的主动脉VSMCs细胞模型;②在体外细胞实验中过表达ABCA1,可以使主动脉VSMCs的凋亡减少,而敲降ABCA1基因可使主动脉VSMCs的凋亡增加;③同时,体外细胞实验中过表达和敲降ABCA1基因分别可以上调和下调与动脉瘤相关的LncRNA ANRIL、HIF1A-AS1和AK056155的表达水平,其中变化趋势最明显的是LncRNA ANRIL。④这可能表明ABCA1基因参与了人主动脉VSMCs的病理生理过程并与LncRNAANRIL可能存在调控关系。第三部分ABCA1基因相关的长链非编码RNA对主动脉平滑肌细胞凋亡和增殖的影响[目的]在人主动脉VSMCs中过表达和敲降LncRNAANRIL,研究其对主动脉VSMCs凋亡和增殖的影响。[方法]利用RNA提取、逆转录和PCR技术在人主动脉VSMCs中钓取ANRIL基因,通过pEGFP-N3构建过表达载体转染人主动脉VSMCs。应用qRT-PCR验证LncRNA ANRIL表达水平。在过表达LncRNA ANRIL的主动脉VSMCs中应用ANNEXIN V-FITC染色结合流式细胞术、MTT比色法和Western blot技术检验细胞的凋亡、增殖情况及凋亡相关蛋白Caspase3和Bcl-2的表达水平。利用siRNA技术在人主动脉VSMCs中敲降LncRNAANRIL。应用qRT-PCR技术鉴定siRNA敲降ANRIL的效率,采用敲降效率最高的siRNA做后续实验。在敲降ANRIL基因的主动脉VSMCs中应用ANNEXIN V-FITC染色结合流式细胞术、MTT比色法和Western blot技术检验细胞的凋亡、增殖情况及凋亡相关蛋白Caspase3和Bcl-2的表达水平。[结果]成功构建ANRIL-pEGFP-N3载体。利用该载体转染人主动脉VSMCs 24h后,转染组各检测结果显示:①LncRNAANRIL水平显著高于对照组(p<0.05);②主动脉VSMCs凋亡率高于对照组(p<0.05);③细胞溶液在A=490nm处的OD值低于对照组(p<0.05)。④Caspase3水平较对照组升高,Bcl-2水平较对照组降低(均为p<0.05)。合成3个ANRIL-siRNA转染人主动脉VSMCs后,qRT-PCR验证siRNA-ANRIL-3的干扰效率最佳,采用其进行后续实验。siRNA-ANRIL-3转染组各检测结果显示:①LncRNAANRIL水平显著低于对照组(p<0.05);②主动脉VSMC凋亡率低于对照组(p<0.05);③细胞溶液在A=490nm处的OD值高于对照组(p<0.05)。④Caspase3水平较对照组下降,Bcl-2水平较对照组升高(均为p<0.05)。[结论]①成功构建过表达和敲降LncRNAANRIL的主动脉VSMCs细胞模型;②在体外细胞实验中过表达LncRNAANRIL,可以使主动脉VSMCs的凋亡增加、抑制增殖,而敲降LncRNAANRIL可使主动脉VSMCs的凋亡减少、促进增殖;③鉴于ABCA1和LncRNA ANRIL在主动脉VSMC凋亡与增殖中的作用,我们推测ABCA1与LncRNA ANRIL的相互作用在主动脉VSMC病理生理过程发挥重要作用,进而影响AAA发生发展。