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本课题通过细胞培养、FCM、PCR、western-blot和Confocal等实验技术,探讨了黄酮类化合物异丹叶大黄素和根皮素对前列腺癌细胞的影响及相关分子机制。具体内容如下:1.异丹叶大黄素诱导雄激素应答型前列腺癌细胞凋亡的分子机制:异丹叶大黄素(Isorhapontigenin,ISOR)是一种二苯乙烯类化合物,结构类似于白藜芦醇。研究表明ISOR具有多种生物学功能,能促进多种肿瘤细胞凋亡,但其作用的具体分子机制和相关的信号通路尚不明确。本文研究了 ISOR促进前列腺癌细胞凋亡及其分子机制,主要包含以下几个方面:1)用ISOR处理前列腺癌细胞和正常细胞后,观察细胞形态学变化,发现ISOR能抑制癌细胞的增殖和黏附。其次,通过MTT实验检测出细胞的存活率呈现降低趋势。预示了 ISOR可能诱导前列腺癌细胞发生凋亡。2)接着,用ISOR处理LNCaP和CWR22Rv1细胞,通过DAPI染色和FCM分析细胞凋亡率,采用western-blot分析凋亡相关基因的表达。结果显示,剪切型的PARP-1和caspase 3表达增加,而XIAP和CyclinD1的表达受到下调;Bax/Bcl-2的比值随ISOR浓度增加而依赖性上升。表明,ISOR促进前列腺癌细胞凋亡。3)然后,通过RT-PCR检测出AR和PSA的基因水平受到ISOR的下调。在AR转录过程中起重要作用的Sp1的表达受到ISOR的下调。Sp1抑制剂MTM预处理细胞后再用ISOR处理,结果表明Sp1可能介导了ISOR对AR的调控。同时,AR的蛋白质水平及活性也呈现出ISOR浓度和作用时间依赖性下降。4)借助蛋白质合成抑制剂CHX与ISOR共同处理癌细胞,结合蛋白酶体抑制剂MG132的使用,发现在ISOR可能促进AR发生蛋白酶体降解。Westem-blot和co-IP实验结果表明,ISOR促进AR泛素化降解。5)实验结果显示,AKT的活性受到ISOR的抑制,且在PI3K的抑制剂LY294002的作用下,细胞存活率进一步下降,p-AKT和AR的表达受到下调。同时,采用western-blot、PCR、蛋白质核质分离技术和Confocal分析发现,FOXO1的活性被激活,ISOR能通过促进FOXOI入核进而提高FOXO1的转录活性。6)最后,检测出ISOR可下调EGFR、ERK1/2的活性。同时,在不同时间点用ISOR处理癌细胞,结合EGF的使用,发现ISOR可直接作用于细胞膜上的EGFR,从而抑制EGFR-AKT和EGFR-ERK信号通路的活性。综上所述,ISOR通过转录水平及翻译水平下调AR蛋白;其次通过直接抑制EGFR的活性下调其信号通路的传递,激活FOXO1的转录活性,从而抑制癌细胞的增殖,促进癌细胞的凋亡。2.根皮素促进前列腺癌细胞凋亡及分子机制研究:根皮素(phloretin),属于二氢黄酮类化合物,研究表明,根皮素具有多种生物活性,但对于根皮素抑制前列腺肿瘤细胞生长、诱导前列腺肿瘤细胞凋亡的具体分子机制研究甚少。本研究通过本研究通过根皮素对前列腺癌细胞的促凋亡作用,探究其诱导前列腺癌细胞凋亡的分子机制,以推动根皮素在抗癌领域的应用。1)通过形态学观察根皮素对WPMY-1、BPH-1、LNCaP、CWR22Rv1、PC3和DU145细胞的影响,发现根皮素对WPMY-1和BPH-1没有影响,但能明显的抑制癌细胞的增殖、生长。MTT结果分析同形态学观察的结果一致。2)通过DNA电泳、DAPI染色、FCM和western-blot分析根皮素是否诱导癌细胞的凋亡,结果表明,癌细胞的凋亡率呈现浓度依赖性升高,cleavedcaspase 3/PARP-1蛋白水平明显上调,caspase家族抑制蛋白X1AP的表达受到下调,而根皮素对p53的表达没有影响。表明根皮素的诱导细胞凋亡是caspase依赖性的。3)研究发现,AKT的Ser473磷酸化水平受到抑制,且下调FOXO1的磷酸化水平。在PI3K抑制剂LY294002作用下,根皮素能进一步下调Cyclin D1、XIAP的蛋白水平及AKT和FOX01的磷酸化水平。4)RT-PCR结果表明,FOXO1的表达水受到根皮素的上调,FOXO1的下游靶基因Bim和p21的蛋白表达水平也相应的受到根皮素的上调,表明根皮素能激活FOXO1的转录活性。免疫荧光实验结果显示,根皮素通过促进FOXO1入核而提高FOXO1的转录活性。5)根皮素能抑制EGFR和ERK1/2的活性,而且根皮素能在短时间内充分抑制EGFR的自磷酸化水平。此外,EGF的存在不能挽救被根皮素所抑制的EGFR的活性。这些表明,根皮素通过与EGFR发生不可逆作用进而抑制EGFR相关的信号通路的活性。以上结果表明,根皮素能通过抑制EGFR的活性,进而抑制其下游信号通路PI3K-AKT和MEK-ERK1/2,上调FOXO1的转录活性,促进与细胞周期停滞和细胞凋亡相关基因的表达,诱导细胞凋亡的发生。