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荚膜是肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)的重要组成成份,GalK、GalE1和GalE2蛋白是肺炎链球菌荚膜合成中的关键酶,用于合成荚膜寡糖重复单位前体UDP-Gal。荚膜在肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,SP)的感染过程中保护致病菌免受宿主免疫系统的识别,它是宿主产生免疫反应的结构基础。荚膜蛋白和多糖已经开始被作为治疗药物研究,但是单纯的多糖半抗原并不能诱导免疫记忆；将致病菌表面多糖共价连接到载体蛋白后形成的糖缀合物疫苗是目前糖药物开发的前沿之一。我们克隆了来自4型肺炎链球菌的半乳糖激酶(Galactokinase,GalK), IPTG诱导GalK蛋白在E. coli BL21(DE3)中表达,带有N-端his6标签的GalK蛋白经过Ni-NTA柱和分子筛纯化,SDS-PAGE电泳结果显示,GalK纯度达到90%以上,单体分子的表观分子量约为37 kDa,与理论推导值基本一致。生物化学及酶学性质分析表明肺炎链球菌GalK蛋白的最适pH为7.5,最适反应温度为45℃。4型肺炎链球菌半乳糖激酶的动力学数据表明,GalK突变体176,1764和176423的定点突变增加了酶对Gal的转化效率；GalK突变体1764,17642和176423的定点突变增加了酶对Glc的转化效率；突变体1764,17642对GlcNAc转化效率相近。ATP不是该酶的唯一磷酸基供体,CTP,dATP,dTTP和dUTP也能被GalK蛋白利用。GalK蛋白催化Gal的转化率为100%,使用3,5-二硝基水杨酸(DNS)分析和计算GalK蛋白野生型及4个突变体176,1764,17642和176423对其余单糖的转化率和活力。4型肺炎链球菌GalK的3个突变体1764,17642和176423在体外能以葡萄糖为底物,而野生型GalK蛋白在体外不能以葡萄糖为底物；利用对葡萄糖转化率较好的GalK突变体176423对葡萄糖进行催化反应,使用3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法与薄层层析(TLC)检测到产物葡萄糖-1-磷酸的生成,反应混合物经硅胶柱纯化并用ESI-MS验证。当磷酸基供体为ATP,糖基供体由半乳糖换为N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺或岩藻糖或阿拉伯糖或鼠李糖,催化反应后使用3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法与薄层层析(TLC)检测产物糖-1-磷酸的生成,并使用MALDI-TOF或1H-NMR或ESI-MS分析。当磷酸基供体换为CTP或dATP或dTTP或dCTP或dUTP,受体为半乳糖,催化反应后使用3,5-二硝基水杨酸(DNS)显色法与薄层层析(TLC)检测产物半乳糖-1-磷酸的生成,产物经ESI-MS分析。同时我们克隆了来自4型肺炎链球菌的半乳糖异构酶(UDP-galactose 4-epimerase,GalE), IPTG诱导GalE1和GalE2蛋白在E. coli BL21 (DE3)中表达,带有N-端his6标签的GalE1和GalE2蛋白经过Ni-NTA柱和分子筛纯化,SDS-PAGE电泳结果显示,GalE1和GalE2蛋白纯度达到90%以上,单体分子的表观分子量约为37 kDa,与理论推导值基本一致。生物化学分析表明4型肺炎链球菌GalE1和GalE2蛋白的最适pH为8.0,最适反应温度为37℃。以UDP-Gal, UDP-GalNAc,UDP-Glc, UDP-GlcNAc为底物进行GalE1和GalE2的底物特异性分析,产物峰用毛细管电泳(CE)检测。UDP-Gal和UDP-Glc是GalE1和GalE2的天然底物,用于验证GalE1和GalE2是否具有酶活。GalE2对UDP-GalNAc具有催化活性,GalE1是否对UDP-GalNAc具有催化活性需进一步验证。GalE2对UDP-GlcNAc具有催化活性,GalE1是否对UDP-GlcNAc具有催化活性需进一步验证。GalE2突变体C300Y和K85G对UDP-GalNAc和UDP-GalNAc具有催化活性,GalE2突变体C300Y对UDP-Glc具有催化活性。