HPLC法检测干酪中黄曲霉毒素M1及生物胺

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干酪是由牛奶经发酵制成的一种营养价值很高的食品。近年来由于我国人民生活水平提高,干酪的人均消费量也在逐年增加。但是,干酪在制作、成熟过程中由于原料、工艺参数控制等原因易产生危害人体健康的生物毒素,其中生物胺和黄曲霉毒素M1(AFM1)是干酪中较常见的两类生物毒素,对人体的危害较大。针对这两种毒素国内外许多研究者也建立了多种检测的方法,但是这些方法都不同程度的存在检测灵敏度低,耗时长,成本高,对检测仪器设备硬件要求过高等问题。因此,本研究从干酪样品前处理,柱前衍生化处理,液相色谱检测条件几个方面着手,针对干酪中的这两类生物毒素的检测建立方法,以解决这些问题。本研究得到以下结果:(1)干酪中生物胺HPLC检测的研究结果:1分别采用三氯乙酸、高氯酸、盐酸、无水乙醇,无水甲醇提取干酪样品中的生物胺并计算6种生物胺的添加回收率以及相对标准偏差。试验结果表明,采用盐酸对干酪样品中的生物胺进行提取,六种生物胺的总体回收率最高,相对标准偏差小于6.7%,提取效果最好。2选择丹磺酰氯(Dns-Cl)作为衍生剂,通过试验确定5mg/ml的丹磺酰氯溶液的最适用量为1ml。衍生反应完成后,因其中含有无机盐等杂质,为了避免在色谱检测中色谱柱受到杂质损害,以及保障生物胺检测的精确度。需要对所得的生物胺衍生物进行富集纯化。通过对比ODS-C18固相萃取方法与乙酸乙酯、乙醚、三氯甲烷三种液-液萃取方法所得的六种生物胺的回收率以及相对标准偏差,确定ODS-C18固相萃取的方法最为适宜,并且操作方法更为简便。通过试验确定固相萃取小柱采用15%的丙酮-水溶液作为杂质淋洗液,生物胺衍生物洗脱溶剂为5mL的乙腈。在10min之内完成生物胺衍生物的固相萃取过程。3确定了HPLC-FD测定干酪中六种生物胺的最佳流动相组合为乙腈和水;梯度洗脱,在25min内乙腈浓度从30%升到100%。在25min内完成组胺、酪胺、色胺、腐胺、尸胺、β-苯乙胺的分析。6种生物胺在上述条件下分离效果良好。在0.110mg·L-1的浓度线性范围内组胺的平均回收率为85.1%90.3%;对-苯乙胺的平均回收率为78.2%82.6%;其余4种生物胺的平均回收率均超过92%。相对标准偏差(RSD)为1.7%6.7%。色胺的最低检出0.0052mg·L-1;组胺为0.0037mg·L-1;酪胺为0.0158mg·L-1;β-苯乙胺为0.0063mg·L-1;尸胺为0.0072mg·L-1;腐胺为0.0182mg·L-1。本方法从样品处理到最后完成6种生物胺的色谱分析,需要8090min,对比现行国标的分析时间(150200min),检测速度提高了一倍。综上所述,本方法是一种检测干酪样品中6种生物胺的既快速又准确的方法。(2)干酪中黄曲霉毒素M1HPLC检测的研究结果:1分别采用乙睛、甲醇、丙酮提取干酪样品中的AFM1,对待测干酪样品进行预处理,并计算AFM1的添加回收率以及相对标准偏差。试验结果表明采用乙睛对干酪样品中的AFM1进行提取,AFM1的回收率最高,提取效果最好。2因为干酪基质中成分较复杂,提取液中势必带有其它杂质,为了得到更高的检测精度,因此需要加入一个AFM1净化提纯的步骤,本试验通过对比采用亲水亲脂柱(OASISHLB)与AFM1免疫亲和柱对AFM1的净化提纯效果,确定最佳的方法。试验结果表明,两种方法对AFM1的净化效果相当,从降低检测成本的角度考虑,采用价格更为便宜的亲水亲脂柱(OASISHLB)对AFM1进行净化提纯。并通过试验确定25%的乙腈-水溶液作为淋洗液,5ml的乙腈作为洗脱溶剂。3本方法在0.14ng/mL的浓度线性范围内对于干酪中AFM1的平均回收率为87.1%92.2%,相对标准偏差(RSD)为1.4%5.7%,最低检出限为0.037μg·kg-1。从检测精度来看与现行国标中第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法无显著差异。本方法从样品处理到最后完成AFM1的色谱分析,需要5060min,对比现行国标GB5413.37-2010中第二法的分析时间(80100min),检测速度提高了3040min。而且亲水亲脂柱的成本约为免疫亲和柱的三分之一。综上所述,本方法是一种检测干酪样品中AFM1的既快速又准确的方法。
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